Fibrinogen Andreas Hillarp Klinisk kemi och transfusionsmedicin Halland andreas.hillarp@regionhalland.se andreas.hillarp@med.lu.se
Koagulationskaskaden (in vitro koagulation i plasma) Intrinsic pathway HMWK PK Extrinsic pathway XII XIIa XI XIa TF VIIa TF VII IX IXa VIIIa X Xa Va Protrombin Trombin Fibrinogen Fibrin
Varför mäta fibrinogen? Förvärvad brist av fibrinogen. Viktig variabel vid flera olika patologiska tillstånd (t.ex. DIC, leversjukdom, trombolys, blödning). Efterfrågas ofta akut. Förvärvad ökning pga. akut-fas reaktion (infektion). Prediktor för transfusionsbehov i samband med kirurgi. Ärftliga bristtillstånd utreds i samband med koagulationsutredningar. Forskningsstudier. Epidemiologiska studier visar att fibrinogen är en riskfaktor för kardiovaskulär sjukdom.
Fibrinogensubstitution vid massiv blödning Fibrinogen kan supplementeras genom Plasma Kryoprecipitat Fibrinogen koncentrat (mest effektivt och säkert!) Gräns när fibrinogen ges varierar <1 g/l <1,5 2,0 g/l Behov av snabb och korrekt mätmetod, allt oftare används (patientnära) visko-elastiska mätmetoder
Kort historik
Några viktiga milstenar Olof Hammarsten, Uppsala, 1880-talet Anrikade fibrinogen, visade att fibrin bildas av fibrinogen Edwin J Cohn, Harvard, 1946 Etanolfraktionering (Cohn s fraction I) Margareta och Birger Blombäck Fibrinogen struktur (dimer, N-terminal sekvensanalys, etc.) Omvandling fibrinogen -> fibrin Abnormalt fibrinogen Foto från Internet (110919): http://www.vonwillebrand.se/sv/von-willebrands-sjukdom/historik/the-failed-experiment-that-saved-lives/
Blombäck & Blombäck Structure of Fibrinogen Ann NY Acad Sci 1972 Molekylstorlek 340 kda Tre par polypeptidkedjor: 2 x Aa 2 x Bb 2 x g Disulfidbundna i en central region
Visualisering av fibrinogen molekylen med 3D kristallografi/atomic Force Microscopy 3D modell (kristallografi) Datasimulering av AFM Yermolenko et al. Biomarcomolecules 2011;12:370-379.
Schematisk modell över fibrinogen och fibrinfibrill Yermolenko et al. Biomarcomolecules 2011;12:370-379.
Trombin D E D Fibrinogen Fibrinopeptider A+B Fibrinmonomer Fibrindimer FXIIIa Tvärbindning av fibrin Protofibrill Plasmin Fibrinfiber Fibrin nedbrytningsprodukter D D D-dimer
Fibrinnätverkets betydelse Gelstruktur och porositet/permeabilitet kan mätas. Används bl.a. för att utvärdera effekt av antikoagulantia och möjligheten till reversering Koagelstrukturen kan associeras med blodproppssjukdom Bestämning av gelpermeabilitet kan kombineras med 3D-bildanalys.
Blombäck M et al., Br J Haematol 2011; 152: 758-765
Fibrinogen är också ett adhesivt protein Adsorberas på främmande ytor medger adhesion av trombocyter och leuokocyter (biokompatibilitet) Ligand till glykoprotein IIb-IIIa ( fibrinogenreceptorn ) Weisel JW 2005
Adhesion och aggregation av trombocyter
ADHESION AGGREGATION Trombocyt Fibrinogen vwf GPIb Trombocyt GpIIb/IIIa
Fibrinogen-generna Tre gener, kluster på kromosom 4: FGA, kodar för Aα-kedjan FGB, kodar för Bβ-kedjan FGG, kodar för γ-kedjan Koordinerat uttryck i levern Expressionen kontrolleras av Hepatocyt-specifika transkriptionsfaktorer (HNF-1) Akut-fas stimulerande faktorer (IL-6RE) Enhancer element Post-transkriptionell reglering med mirnas
Ärftliga fibrinogenbrister (orsakad av mutationer i FGA, FGB eller FGG) Afibrinogenemi = total avsaknad Hypofibrinogenemi = låga halter Dysfibrinogenemi = defekt protein Hypodysfibrinogenemi = kombination av låga halter och defekt protein
Förvärvade bristtillstånd Typ Orsak Exempel Fenotyp Förvärvad hypofibrinogenemi Nedsatt syntes Ökad konsumtion Leversjukdom Trombolys, cancer, sepsis, DIC Variabel blödning Variabel blödning/ asymptomatisk Hemodilution Massiv transfusion Variabel blödning Förvärvad dysfibrinogenemi Posttranlationell modifiering Abnormal sialylation i levern Variabel, blödning el. trombos Autoantikroppar Metod interferens Paraneoplastisk syntes av abnormal fibrinogen MGUS, autoimmunitet Trombinhämmare Cervixendotel Variabel, blödning el. trombos Variabel blödning/ asymptomatisk Variabel, blödning el. trombos Modifierad från Besser & MacDonald J Blood Med 2016; 7: 217-225.
Hur kan vi mäta fibrinogen på ett kliniskt rutinlaboratorium? Funktionella metoder: - Gravimetri/syneres (koagulerbart protein) - Kronometriska tester (koagulationstid) - Fotometriska tester - Metoder baserade på PT-reaktionen Immunologiska metoder - Elektroimmunoassay - Nefelometri - ELISA
Fibrinogen enligt Clauss Clauss A. Acta Haematol. 1957; 17: 237-246 Ger information om både fibrinogenets koncentration och kvalitet. Samtliga svenska laboratorier inom EQUALIS koagulationsprogram (2016; n=74) CLSI dokument H30-A2 Formell nomenklatur: Plasma-Fibrinogen, masskonc. (koag.; IS09/264) = g/l IFCC/IUPAC kod: NPU29399
Mätprincip Clauss fibrinogenmetod: En standardiserad mängd trombin blandas med testplasman och tiden till ett koagel bestäms. Fibrinogen Trombin 37 C Fibrinkoagel Koagulationstiden är omvänt proportionell mot fibrinogenkoncentrationen. Kalibreras med en referensplasma som analyseras i en spädningsserie (ställd mot IS).
Procedur enl. CLSI dokument H30-A2: Prover och kontroller späds 1:10 med barbitalbuffer, inkubera 37 C, 5 min. Tillsätt 0,1 ml trombinlösning till 0,2 ml spädd plasma. Mät koagulationstiden och läs av fibrinogenkoncentrationen på standardkurvan. Svara med g/l (IFCC-IUPAC)
Att tänka på när man använder Clauss-metoder: Standardkurvan bör ha minst 5 punkter. Kalibrator ska ha spårbarhet till WHO IS. Anpassa spädningen om resultatet ligger utanför den linjära delen av kurvan (1:3-1:40). Trombinlösningen har begränsad hållbarhet, notera risk för carry-over - trombin kräver extra tvätt. Möjliga interferenser i plasma: Anti-trombin antikroppar (spec. bovint trombin) Fibrinogen/fibrin nedbrytningsprodukter (FDP) Heparin och direkta trombinhämmare Hemodilution?
Concentration
Kalibreras med internationell standard för fibrinogen i plasma Före 1989: stora skillnader i uppmätt fibrinogen. (Furlan et al., 1989) WHO 1st IS (NIBSC code 89/644) Gravimetriskt bestämd till 2,4 mg/ampull WHO 2nd IS (NIBSC code 98/612): Kalibrerad mot 1st IS, bestämd till 2,2 mg/ampull med Clauss-metodik WHO 3rd IS (NIBSC code 09/264): Kalibrerad mot 2nd IS, bestämd till 2,7 mg/ampull med Claussmetodik
CV (%) Resultat fibrinogen 2014 (alla med Clauss-metod i samma metodgrupp) Equalis utskick 2014
Fibrinogen, problem med metodberoende resultat Majoritetsreagenset får stor inverkan på totalmedelvärdet (2015: Dade Thrombin 44/73 lab) Mindre vanliga reagens avviker >2SD (utan möjlighet att korrigera - metodberoende) 2016: Introduktion av fler metodgrupper
Samtliga deltagare med fibrinogen 2014/2015 Metod/reagens Utskick 2014:01 Utskick 2015:01 Dako polyklonal antikropp 1 1 Dade Thrombin 37 44 Fibrinogen C 5 5 Fibri-Prest 3 2 Multifibren U 2 - QFA Fibrinogen 11 8 STA Fibrinogen 8 11 STA Liquid Fib - 2 Totalt antal lab 67 73
Fibrinogen: uppdelat på material och metod Medelvärden (g/l) för samtliga användare och utskick 2015 Material Dade Thrombin QFA Fib STA Fib Fib C Fibri- Prest STA Liquid Dako (imm) Koag 96 2,19 2,03 2,49 1,98 2,27 2,61 2,67 Koag 97 1,50 1,55 1,72 1,56 1,63 1,70 1,80 Koag 98 1,53 1,58 1,77 1,56 1,63 1,78 1,89 Tydliga metodolikheter!
Equalis rapport 2017:1 Tabell 6 kolumner 6 rader
Equalis: P-Fibrinogen (g/l); Youden plot 2016:01; n = 70 (n= 41) (n= 9) (n= 9) (n= 5) (n= 4) (n= 1)
CS-5100 IU/mL Instrumentberoende? Sysmex CS-2100 vs CS-5100 Från Agnes Rasmuson och Jovan Antovic Karolinska, 170208 9 8 7 y = 0,926x + 0,072 R² = 0,992 Fibrinogen 6 5 4 3 2 1 0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 CS-2100 (g/l)
CS5100 -CS2100 (g/l) Absolut skillnad (g/l) 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 0-0,2 1 2 3 4 5 6 7 8 9-0,4-0,6-0,8-1 CS-2100 (g/l) Från Agnes Rasmuson och Jovan Antovic Karolinska, 170208 14% 12% 10% 8% 6% 4% 2% 0% -2% -4% -6% -8% -10% -12% -14% Relativ skillnad (%) 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 CS-2100 (g/l)
Alternativ mätning av fibrinogen med viskoelastisk koagulationsmätning (TEG/ROTEM) Koagulation induceras under låga skjuvningskrafter (shear) venös reologi Mäter hur koagel bildas och löses upp (kinetik) Mäter koaglets fysikaliska egenskaper (hastighet, styrka/stabilitet). Fibrinogen är en viktig komponent som bidrar till koaglets egenskaper.
TROMBELASTOGRAFI (TEG) Haemoscope Corp. TEG 5000 Hemostasis Analyzer ROTATIONAL THROMBELASTOMETRY (ROTEM) TEM International GmbH: ROTEM Delta Kassettbaserat system ROTEM Sigma
ROTEM Citratblod placeras i mätkyvett med en cylindrisk sond. Testtid ca. 5 10 min. Sonden är monterad i en axel som oscillerar fram och tillbaka Koagulationsbildning påverkar sondens rörelsemönster och registreras
ROTEM (TEG)
FIBTEM: test med och utan trombocythämmare
Korrelation mellan Clauss fibrinogen (g/l) och ROTEM (MCF)
Att mäta det omätbara
REFERENSINTERVALL (RI) Med ett RI så anger vi det förväntade resultatet hos en undersökt som liknar referenspopulationen. Etableras genom undersökning av ett urval av friska individer med tillräcklig statistisk säkerhet. Enligt ISO 15189:2012 ska våra RI granskas regelbundet, efter metodförändringar etc.
REFERENSINTERVALL forts. Kan vara svårt att lokalt definiera, etablera och verifiera Få laboratorier bestämmer egna RI Särskilt svårt med barn, åldriga, gravida etc.
Hur gör vi då? Försöker överföra ett etablerat RI till lokala förutsättningar. Det kan vara från: Annat lab Tillverkarens undersökningar Vetenskaplig litteratur/läroböcker Måste på något sätt visa att valt referensintervall är lämpligt: Metod, instrument Population, etnicitet, fördelning av ålder, kön Jämförbara preanalytiska förhållanden, etc. Verifiera uppgifterna genom egna tester
Fibrinogen RI = 2,0 4,0 g/l? Allmänt accepterat RI för fibrinogen Hur kan detta verifieras lokalt? CLSI C28 A33 föreslår: Samla in och analysera 20 prov från friska individer. Måste representera den lokala populationen. Är 18/20 prover innanför RI kan det accepteras Alternativt så kan en retrospektiv genomgång av lokal resultatdatabas verifiera ett föreslaget RI
Veta mer?
Kan vi ha ett gemensamt/nationellt RI? Det ideala gemensamma RI för en region eller land bör ha tagits fram för just det syftet. NORIP (ej koag) Kännedom om populationen Förväntad pre-analytik Kunskap om den analytiska processen Ett gemensamt RI får troligen ett vidare intervall än vad ett enskilt lab skulle generera ( priset )
Fibrinogen Vad är korrekt referensintervall? Intervallet 2 4 g/l generellt accepterat Enkelt och bra, egentligen inte varit ifrågasatt Undre gräns nu av särskilt intresse finns riktlinjer för fibrinogensubstitution vid olika situationer Tillverkarna egna ref. intervall kan dock variera Spänner över 1,7 4,2 g/l Rekommenderar lokalt etablerade intervall Om 2-4 g/l är allmänt accepterat i vårdriktlinjer etc. så stämmer det inte med verkligheten
Urklipp ur gammmal metodbeskrivning, Malmö 1976
Mer moderna exempel: D Levy et al., Transfusion 2014; 54: 1389. D? Fish & Neerman-Arbez Thromb Haemost 2012; 108: 419. Besser & MacDonald J Blood Med 2016; 7: 217-225.
Tillverkarnas rekommendationer Stago IL STA Liquid Fibrinogen 2,0 4,0 g/l, avser vuxna individer, icke gravida, ref. från 1999 QFA Fibrinogen på ACL TOP 2,0 3,9 g/l, n = 120 Siemens Dade Thrombin: 1,8 3,5 g/l, hänvisar till tysk referens från 1998 Applikation på Sysmex CS-series: 1,7 4,2 g/l, 2,5 97,5 percentil, n = 308
Några exempel från svenska lab Halland: 2,0 4,0 g/l Skåne: 2,0 4,0 g/l Karolinska: 2,0 4,2 g/l Sahlgrenska: 1,8 3,8 g/l Dalarna: 2,0 4,0 g/l Aleris: 2,0 4,0 g/l Akademiska: 2,0 3,6 g/l Jönköping: 1,8 3,8 g/l Örebro: 2,0 4,0 g/l Gävle: 2,0 4,0 g/l
Försök till lokalt RI för fibrinogen Material från NÄL (n=23); SU (n=20); Linköping (n=93), totalt n=136 (Inger Fagerberg-Blixter och Tomas Lindahl) Friska frivilliga Kontrollerad preanalytik Samma metod etc.
Lokala RI för fibrinogen baserat på medelvärden +/- 2SD SU, n=20; medel: 2,76 g/l (2,09 5,02) +/- 2SD = 1,5 4,0 g/l NÄL, n=23; medel: 2,81 g/l (2,19 3,55) +/- 2SD = 2,0 3,7 g/l LiU, n=93; medel: 2,81 g/l (1,63 4,49) +/- 2SD = 1,7 3,9 g/l Hela materialet, n=136 medel: 2,80 g/l, n=136 +/- 2SD = 1,7 3,9 g/l
Analys av resultaten: Parametriskt vs. icke parametriskt Parametrisk beräkning förutsätter normalfördelning (Gauss-kurva) Grafisk inspektion Transformering (t.ex. logaritmering) till ny skala och testar för ev. normalfördelning Icke-parametriskt kräver inte normalfördelade resultat. RI baseras (oftast) på 95% av den centrala fördelningen (2,5 97,5 percentilen). Rek. av CLSI.
Parametriskt test, RI beräknat på medelvärde +/- 2 SD RI: medelvärde +/- 2SD = 1,7 3,9 g/l
Efter transformering (ln) parametriskt test, RI beräknat på medelvärde +/- 2 SD 95 % RI: 1,9 4,0 g/l
Icke-parametriskt test, RI beräknat 95 % 95 % RI: 2,0 4,2 g/l
RI för fibrinogen enligt olika beräkningar Hela materialet, n=136 A) Parametriskt, medelvärde +/- 2SD 1,7 3,9 g/l B) Parametriskt Transformerade (ln) resultat, medel +/- 2SD 1,9 4,0 g/l C) Icke-parametriskt 2,5 97,5 percentil 2,0 4,2 g/l
Fibrinogen Summering: Del 2 Fibrinogen och referensintervall Samtliga lab använder Clauss metod Känt att vi har reagensberoende resultat, därmed bör vi ha lite olika RI Referensintervall Tillverkarens rekommendationer Uppgifter i vetenskaplig litteratur Lokalt etablerat RI CLSI C28 kan ge god vägledning
TACK FÖR UPPMÄRKSAMHETEN! Bästa mötet! Välkommen till Vårmötet i Halland 5-7 april 2017 Hotell Tylösand
Hemodilution med plasmaexpanders Syntetiska kolloider kan ge falskt höga fibrinogen resultat mätt med Clauss metod enl. in vitro försök Optiskt > mekanisk analysprincip? Effekt varierar med reagenstyp Är (vissa) Clauss-metoder mindre lämpliga i samband med hemodilution?
Hemodilution in vitro (Fenger-Eriksen et al. Transfusion 2010) = plasma spädd 50 % isoton salin = plasma spädd 50 % med 5 % albumin = plasma spädd 50 % med HES 130/0.4
Effekt av utspädning Före efter 1 L HES -31 % -29 % -25 % -44 %
Kort summering: Del 1 Fibrinogen och mätmetoder Fibrinogen viktig för adhesion och koagelbildning. Funktionella tester ger information om både koncentration och kvalitet. Clauss-metoder vanligast men skillnader finns mellan olika reagens. Viskoelastiska tester kan ge komplementär information om koagulerbart fibrinogen (preperioperativt).