Protein C och S på laboratoriet. Andreas Hillarp Labmedicin Skåne Klinisk kemi, Koagulationslaboratoriet Skånes universitetssjukhus, Malmö

Storlek: px

Starta visningen från sidan:

Download "Protein C och S på laboratoriet. Andreas Hillarp Labmedicin Skåne Klinisk kemi, Koagulationslaboratoriet Skånes universitetssjukhus, Malmö"

Camilla Isaksson
för 7 år sedan
Visningar:

1 Protein C och S på laboratoriet Andreas Hillarp Labmedicin Skåne Klinisk kemi, Koagulationslaboratoriet Skånes universitetssjukhus, Malmö

2 Vitamin K-beroende proteiner Vitamin K nödvänding för -karboxylering av vissa glutaminsyror (Gla) Faktor II (protrombin) Faktor VII Faktor IX Faktor X Protein C Protein S m.fl. Ger en kalciumbindande förmåga Warfarin (Waran ) hämmar bildandet av Gla

4 Beskrev protein C 1975 Besk

5 Koagulationsfaktorer i plasma Var kommer protein C och S in? Faktor I Faktor II Faktor III Faktor IV Faktor V Faktor VII Faktor VIII Faktor IX Faktor X Faktor XI Faktor XII Faktor XIII Fibrinogen Protrombin Vävnadsfaktorn (tissue factor) Kalcium Proaccelerin, labila faktorn Prokonvertin, stabila faktorn Antihemofilisk globulin (AHG) Christmas faktor Stuart-Prower Faktor Plasma tromboplastin antecedent (PTA) Hageman faktor Fibrin stabiliserande faktor

6 Jonbyteskromatografi (DEAE-Sephadex) av vitamin K-beroende plasmaproteiner Pool C IX II X

7 Biochemistry 1977; 16: ?

8 Plasmakoagulationen Intrinsic pathway HMWK PK XII XIIa XI XIa Extrinsic pathway TF VIIa TF VII IX IXa VIIIa X Xa Va Protrombin Trombin Fibrinogen Fibrin

9 NATURLIG ANTIKOAGULATION I PLASMA Intrinsic pathway HMWK PK XII XIIa XI XIa Extrinsic pathway TF VIIa TF VII TFPI Antitrombin (+heparansulfat på endotelyta) IX IXa VIIIa X Xa Va Protrombin Trombin Protein C systemet Fibrinogen Fibrin Fibrinolys

10 Protein C systemet HMWK PK XII XIIa XI XIa IX IXa VIIIa X Xa Va +Protein S APC Protein C EPCR Trombomodulin Protrombin Trombin Fibrinogen Fibrin

11 Protein C Vitamin-K-beroende proenzym till ett serinproteas (aktiverat protein C [APC]) Kofaktorer: protein S och faktor V Ca. 62 kda (23 % kolhydrat), 419 aminosyror Koncentration 3-5 mg/l Halveringstid 6-8 timmar Hämmas av protein C hämmaren (PCI) m.fl.

12 Bestämning av protein C Immunologiska metoder (antigenkoncentration) Laurells raketelektrofores ELISA, LIA Funktionella metoder vilka funktioner ska/kan testas? - Aktivering av trombin-trombomodulin komplexet - Interaktion med endotelcellsreceptor - Interaktion med fosfolipid - Interaktion med kofaktorer (protein S, faktor V) - Interaktion med substrat (Va, VIIIa) Praktisk kompromiss: semi-funktionell metod Enzymatisk aktivering av protein C med ormgift och kvantifiering med kromogent substrat eller koagulationstid

13 Protein C analys med direkt substratmetod Protac 1. Protein C APC 2. Substrat (peptid-pna) Peptid + pna (färg) Protac är ett trombin-liknande enzym (ormgift) APC verkar direkt på substratet. Frisättning av pna ger upphov till färgutveckling vilket detekteras vid 405 nm (mod/min) Absorbansen blir direkt proportionell mot APC-koncentrationen

14 Koagulationsbaserad funktionell HMWK PK XII XIIa metod för protein C Protein C XI XIa Protac IX IXa VIIIa X Xa Va Protrombin +Protein S Trombin Fibrinogen APC Fibrin Analysgång: 1 del utspädd plasma 1 del PC-brist plasma 1 del Protac + koag. aktivator Inkuberas 3 min, 37 C 1 del kalciumklorid Koagulationstiden detekteras

15 Protein S Kofaktor till APC (ej enzym) Ca. 75 kda (6 % kolhydrat), 635 aminosyror Koncentration mg/l I plasma är ca. 70 % av protein S bundet till C4b-bindande protein (C4BP)

16 Interaktion med C4b-bindande protein (C4BP) PS C4BP 1:1 stökiometri Hög affinitet (Kd 5x10-10 M) Ca 70% av protein S i plasma är bundet till C4BP Bundet protein S har ingen APC-kofaktor aktivitet Protein S i komplex med C4BP kan binda till neg. laddad fosfolipid/apoptotiska celler nedreglering av koagulation och komplement på ytan av apoptotiska celler... PS

17 Bestämning av protein S Laurell raketelektrofores Radioimmunoassay (± PEG fällning) ELISA (± PEG fällning) Monoklonal ak för bestämning av fritt protein S C4BP-baserade metoder för fritt protein S Funktionella metoder (koagulationsbaserade) Genetisk undersökning (ej för rutin)

18 Bestämning av fritt protein S (1) med monoklonala antikroppar (ELISA) ELISA =Enzyme-linked immunosorbent assay Protein S Antikropp C4BP

19 Bestämning av fritt protein S (2) med C4BP (ELLSA) ELLSA =Enzyme-linked ligandsorbent assay C4BP Protein S Kd 5 x10-10 M Utnyttjar den höga affiniteten mellan protein S och dess naturliga ligand C4BP

20 Europeiskt kvalitetsorgan med fokus på koagulationsanalyser Trombofilimodul: - Antitrombin - Protein C antigen - Protein C aktivitet - Protein S, totalt - Protein S, fritt - Protein S, aktivitet - APC resistens test - APC resistens test (med spädning i FV-brist plasma)

21 2010 Metoder för protein C och protein S i citratplasma Analyt Analysprincip Antal deltagande lab Antal olika metoder (tillverkare) Protein C Antigen (ELISA, LIA) Aktivitet: substrat Aktivitet: koagulation 81 5 Protein S Totalt Fritt Aktivitet Tillverkare med >10 deltagande lab: BioMérieux, Stago Chromogenix, IL, Siemens, Stago, IL, Siemens, Stagol Stago IL, Stago IL, Siemens, Stago

22 ECAT exercise Provmaterial: Plasma från patient med heterozygot protein C brist

24 ECAT exercise Provmaterial: Plasma från patient med heterozygot protein S brist Totalt protein S Fritt protein S

25 Protein S aktivitet

26 Analytiska aspekter: - Bristtillstånd och klassificering - Många faktorer påverkar nivåer - Provhantering och analysmetoder Speciellt problematiskt med protein S

27 Protein S koncentration Exempel på protein S utredning (1) kie/l Normal fenotyp (ingen brist) 1.00 cut-off nivå Total PS Fritt PS PS aktivitet

28 Protein S koncentration Exempel på protein S utredning (2) kie/l Typ I brist (kvantitativ) 1.00 cut-off nivå Total PS Fritt PS PS aktivitet

29 Protein S koncentration Men oftast ser det ut så här! kie/l 1.00 cut-off nivå Total PS Fritt PS PS aktivitet

30 Fall med misstänkt protein C-brist Kvinna, 35 år, helbenstrombos. Använder p-piller. Har tidigare haft pneumonier/lungemboli samt ventrombos postpartum. Trombosutredning: PK(INR) (<1,2) 0,9 APTT (24-37 sek) 29 Lupus antikoagulans (<1,5) 1,7* Antitrombin (0,80 1,20 kie/l) 1,17 Protein C (0,70 1,30 kie/l) 0,65* Nya tester: (0,25-0,54) Protein S (0,60 1,30 kie/l) 1,14 B-DNA Faktor V 1691 G-A (APCresistens genotyp) B-DNA Faktor II G-A (Protrombin (Fll) genotyp) G/G (normal) G/G (normal)

31 Fördelning 0.8 Överlapp! 0.6 Patienter (protein brist) Friska individer (ej protein brist) Proteinkoncentration (kie/l)

32 Fler faktorer som kan ha betydelse för proteinkoncentrationen i plasma Kön Ålder Graviditet Hormonell status/östrogen Variation över dygnet, säsong Leverskada, DIC Förvärvad brist (antikroppar) AVK-behandling: normalisering 2-4 veckor! Polymorfismer

33 Summering: Att beakta vid bestämning av protein C och S Många olika metoder, generellt är det tillräckligt att analysera: Protein C, aktivitet (kromogen substratmetod) Protein S, fritt Många omgivningsfaktorer kan påverka resultatet! Normalisering kan ta 2-4 veckor efter waranbehandling. Gråzon där det är svårt att avgöra om brist föreligger. Enstaka provresultat kan inte utgöra grund för bristklassificering. För att säkerställa ett bristtillstånd bör resultatet verifieras med ny provtagning, ev. kompletteras med familjeutredning

34 Tack för uppmärksamheten

35 onsdag den 2 februari 2011

36 Protein S koncentration Exempel på protein S utredning (3) kie/l Typ II brist (kvalitativ)? 1.00 cut-off nivå Total PS Fritt PS PS aktivitet

37 Protein S koncentration Exempel på protein S utredning (4) kie/l Typ III brist 1.00 cut-off nivå 0.50 ( ) 0.10 Total PS Fritt PS PS aktivitet

Relevanta dokument

ÅRET SOM GÅTT APTT-ANTITROMBIN-FIBRINOGEN Equalis 2014: APTT Aktiverad partiell tromboplastintid A. Hillarp

ÅRET SOM GÅTT APTT-ANTITROMBIN-FIBRINOGEN Equalis 2014: APTT Aktiverad partiell tromboplastintid A. Hillarp (andreas.hillarp@regionhalland.se) Reaktioner som påverkar APTT Intrinsic pathway HMWK PK Extrinsic