Trombosutredning molekylär diagnostik av generna F2 och F5 Klinisk kemi och Transfusionsmedicin i Halland

Storlek: px

Starta visningen från sidan:

Download "Trombosutredning molekylär diagnostik av generna F2 och F5 Klinisk kemi och Transfusionsmedicin i Halland"

Klara Bergqvist
för 8 år sedan
Visningar:

1 Trombosutredning molekylär diagnostik av generna F2 och F5 Klinisk kemi och Transfusionsmedicin i Halland andreas.hillarp@regionhalland.se

2 APC-resistens Fenotypen motsvaras av en genotyp (FV G1691A, FV Leiden) Omslagsbild 1997 RFLP av FV G1691A

3 Venös trombossjukdom Årlig incidens ca. 1-2/1000 individer Lab: Akut test: D-dimer + efterföljande trombosutredning

4 Blodkoagulationen: balans mellan fast och flytande TROMBOS BLÖDNING PROKOAGULATION ANTIKOAGULATION normaltillståndet

5 Blodpropp Virchows triad Rudolf Virchow ( ) patologins fader "omnis cellula a cellula"

6 Virchows triad tre bidragande orsaker till trombosbildning HYPERKOAGULABILITET (förändrad sammansättning av blodet ) KÄRLVÄGGEN (skada på endotelet) HEMODYNAMIK (blodtryck och flöde)

7 Några gener i hemostasen Prokoagulanta faktorer Fibrinogen, FGA, FGB, FGG Protrombin (faktor II), F2 Faktor V, F5 Faktor VIII, F8 Faktor IX, F9 Faktor X, F10 Faktor XI, F11 Faktor XII, F12 Faktor XIII, F13A, F13B Antikoagulanta faktorer Protein C, PROC Protein S, PROS Antitrombin, SERPINC1 Andra faktorer Kininogen, KNG Prekallikrein, KLKB1 Karboxylas, GGCX von Willebrand faktor, VWF Farmakogenetik Vitamin-K-Epoxide-Reduktas,VKORC1 Cytokrom P450 2Y9, CYP2C9 Cyklooxygenas 1, COX1 + alla gener som styr trombocytaktivteter, endotelcellsproteiner

Antitrombin, SERPINC1 Andra faktorer Kininogen, KNG Prekallikrein, KLKB1 Karboxylas, GGCX von Willebrand faktor, VWF Farmakogenetik

8 Gener i rutinmässig trombosutredning Prokoagulanta faktorer Fibrinogen, FGA, FGB, FGG Protrombin (faktor II), F2 Faktor V, F5 Faktor VIII, F8 Faktor IX, F9 Faktor X, F10 Faktor XI, F11 Faktor XII, F12 Faktor XIII, F13A, F13B Antikoagulanta faktorer Protein C, PROC Protein S, PROS Antitrombin, SERPINC1 Andra faktorer Kininogen, KNG Prekallikrein, KLKB1 Karboxylas, GGCX von Willebrand faktor, VWF Farmakogenetik Vitamin-K-Epoxide-Reduktas,VKORC1 Cytokrom P450 2Y9, CYP2C9 Cyklooxygenas 1, COX1 + alla gener som styr trombocytaktivteter, endotelcellsproteiner

PROS Antitrombin, SERPINC1 Andra faktorer Kininogen, KNG Prekallikrein, KLKB1 Karboxylas, GGCX von Willebrand faktor, VWF Farmakogenetik

9 Faktorer i plasma Koagulationskaskaden Tolv klassiska koagulationsfaktorer Faktor I Fibrinogen Faktor II Protrombin Faktor III Vävnadsfaktorn (tissue factor) Faktor IV Kalcium Faktor V Proaccelerin, labila faktorn Faktor VII Prokonvertin, stabila faktorn Faktor VIII Antihemofilisk globulin (AHG) Faktor IX Christmas faktor Faktor X Stuart-Prower Faktor Faktor XI Plasma tromboplastin antecedent (PTA) Faktor XII Hageman faktor Faktor XIII Fibrin stabiliserande faktor

Prokonvertin, stabila faktorn Faktor VIII Antihemofilisk globulin (AHG) Faktor IX Christmas faktor Faktor X

10 Koagulationskaskaden (in vitro koagulation i plasma) Intrinsic pathway HMWK PK Extrinsic pathway XII XIIa XI XIa TF VIIa TF VII IX IXa VIIIa F5 F2 X Xa Va Protrombin Trombin Fibrinogen Fibrin

11 Naturlig antikoagulation Intrinsic pathway HMWK PK Extrinsic pathway XII XIIa XI XIa IX IXa VIIIa TF VIIa TF VII TFPI Protein C systemet Antitrombin X Xa Va Protrombin Trombin Fibrinogen Fibrin

12 Venös trombossjukdom Multifaktoriell Omgivning/miljöfaktorer Ärtflighet oberoende riskfaktorer: Antitrombin (SERPINC1) Protein C (PROC) Protein S (PROS1) APC resistens/faktor V Leiden (F5) Protrombingenmutation (F2) Bristtillstånd avser heterozygoti

Protein C (PROC) Protein S (PROS1) APC resistens/faktor V

13 Antitrombin Risk och prevalens Protein C Protein S FVL (het) PT mut (het) FV HR2 Reitsma & Rosendaal JTH 2007

14 Trombosutredning varför inte alltid DNA-analys? Antitrombin, protein C och protein S Mätning i plasma (fenotyp) APC resistens och protrombingenmutation DNA-test (genotyp): * APC resistens; FV Leiden; FVR506Q; FVG1691A (B-DNA FV c.1691 G>A) Protrombingenmutation, PTmut; protrombin G20210A allel; m.fl. namn (B-DNA FII c G>A)

protrombingenmutation DNA-test (genotyp): * APC resistens; FV Leiden; FVR506Q;

15 Antitrombindefekter Typ av brist Koncentration i plasma Aktivitet i plasma Antal kända mutationer Kommentar Typ I Reducerad Reducerad 92 Vanligaste formen ( klassisk brist ) ( 50%) ( 50%) Typ II RS ( reactive site ) Typ II HBS ( Heparin binding site ) Normal Reducerad 12 Defekt inaktivering av proteinas Normal Reducerad 12 Normal aktivitet i frånvaro av heparin! Mild trombosrisk i heterozygot form Typ II PE ( pleiotropic effect ) Normal (ev. reducerad) Reducerad 11 Mutationdatabas: www1.imperial.ac.uk/medicine/about/divisions/is/haemo/coag/antithrombin/default.html

inaktivering av proteinas Normal Reducerad 12 Normal aktivitet i frånvaro av heparin!

16 Antitrombin (SERPINC1) = HBS = RS = PE

17 Strandberg K, Läkartidningen 2011; 108: 1552

18 Mutationer vid protein C brist Många olika mutationer beskrivna! PROC gen mrna Protein

19 Protein S: extra svårigheter med genetisk analys Två protein S gener, PROS1 and PROS2 (P) Stor gen (>100 kb), lokaliserad till centromeren, stor likhet mellan generna (exon 97%, intron 94,5%) Dåligt definierad promoter och genreglering I hälften av familjer med protein S brist hittas inga mutationer i PROS1! 172 (53%) mut+ 13 studier: 323 familjer 151 (47%) mut-

intron 94,5%) Dåligt definierad promoter och genreglering I hälften av familjer med

20 Alltså Flesta familjer med brist på antitrombin, protein C eller protein S har unika mutationer. Kostnadseffektivitet? Måste sekvensera hela gener inkl. introner, leta deletioner etc. Funna genvarianter kan vara svårbedömda Mutation? (sjukdomsframkallande eller ej?) Polymorfism?

Måste sekvensera hela gener inkl. introner, leta deletioner etc.

21 Varför fungerar DNA-analys för APC resistens och protrombingenmutationen?

22 En kort tillbakablick: APC resistens/fv Leiden Upptäcktes av Björn Dahlbäck i Malmö 1993 Sökning på PubMed APC resistance = 2209 träffar Factor V Leiden = 4229 träffar

23 Första familjen med APC resistens Dahlbäck B et al., Proc Natl Acad Sci USA 1993; 90:

24 Protein C systemet HMWK PK XII XIIa XI XIa IX IXa VIIIa TF VIIa VIIIi TF VII + APC Protein S EPCR Protein C X Xa Va Vi Protrombin Trombin Fibrinogen Fibrin Trombomodulin

25 Clotting time (seconds) Förklaring av begreppet APC resistens control APC resistance Activated protein C (ug/ml) Dahlbäck B 1993

26 APC resistens/fv Leiden orsakas av en punktmutation i faktor V genen F5 gen Exon 10 Substitution G1691A orsakar Arg506 till Gln (kallad FV Leiden )

27 Varför orsakar APC resistens/fv Leiden trombos?

28 APC-resistens: mekanism (1) Faktor V A1 A2 B A3 Trombin aktivering C1 C2 Faktor Va Ca 2+ APC inaktivering Faktor Vi Ca 2+

29 APC-resistens: mekanism (2) Faktor Va APC inaktivering av faktor Va : : Ca 2+ Faktor V:R 506 gac agg cga gga ata... (normal)... D R R G I APC Faktor V:Q 506 gac agg caa gga ata... (muterad... D R Q G I APC

30 Protrombingen (F2) mutationen

31 Lokalisering av mutationen (G20210A) till 3 otranslaterad region! 1 kb Exon F2 gen UT G ATGGTTCCCAATAAAAGTGACTCTCAGC AGCCTC... A

32 Molekylär mekanism F2 G20210A? Mutation associerad med ökat protrombin oklart varför. Påverkar poly(a). Ökad mrna stabilitet? In vitro: Stabilare mrna, reducerad degradering In vivo: Ökad translationsförmåga Förändrad glykosylering, stabilare protein?

33 Hur ofta hittas en ärftlig riskfaktor vid venös trombos? Förekomst i svensk trombospopulation: Brist på antikoagulant protein Antitrombin 1-2% Protein C 2-5% Protein S 2-5% APCr (FV Leiden) 20-60% Protrombin G20210A 6-8%

34 Fördelning av FVL och PTmut i världen Europa och Nordamerika FVL 1-15 % PTmut 2-7 % Kina 0% Japan 0% Indianer i Nord- och Sydamerika 0% Australien FVL 5 % PTmut 2-4 % Afrika 0% Aboriginer 0% Båda mutationerna saknas hos ursprungsbefolkningar i Afrika, Amerika, Asien och Australien.

35 Mutationen har alltså uppstått hos en enda individ. (Alla med FV Leiden är släkt ) -samma sak har visats för protrombingenmutationen. Alla homozygota har samma haplotyp!

36 Uppskattning av mutationsåldern F2 genen F5 genen Studerat SNPs och µ satellitdata hos homozygota individer Antagit att en generation är 20 år, bearbetat med mjukvara DMLE+2.0 Zivelin et al. Blood 2006;107:

37 Mutationerna i F2 och F5 generna har endast uppstått en gång i världshistorien! Mutationen som orsakar APC resistens uppstod hos en individ för ca år sedan. Protrombingen G20210A allelen uppstod också hos en individ för ca år sedan. I båda fallen uppstod mutationerna hos vita personer (kaukasier) i området kring östra medelhavet eller mellanöstern. (efter utvandringen från Afrika och rasuppdelningen)

38 Är DNA-analys alltid bäst? Transplantationer (benmärg, lever; genotyp fenotyp) Pseudohomozygoti (förekomst av nollallel) Klinisk signifikans? Försök in vitro visar på högre grad av trombogenicitet. Andra mutationer som påverkar resultatet Falskt positiva/negativa resultat? FV Graz (falskt positiv) Andra mutationer som ger en APC resistens fenotyp missas. Fem varianter beskrivna: FV HongKong; FV Cambridge; FV Liverpool; Glu666->Trp; Trp1920->Arg Kostnadseffektivitet?

39 Tack för uppmärksamheten!

Relevanta dokument

Protein C och S på laboratoriet. Andreas Hillarp Labmedicin Skåne Klinisk kemi, Koagulationslaboratoriet Skånes universitetssjukhus, Malmö

Protein C och S på laboratoriet Andreas Hillarp Labmedicin Skåne Klinisk kemi, Koagulationslaboratoriet Skånes universitetssjukhus, Malmö Vitamin K-beroende proteiner Vitamin K nödvänding för -karboxylering