Hemoglobinutredningar på Karolinska. Christin Sisowath Sjukhuskemist Karolinska Universitetslaboratoriet, Klinisk kemi

Storlek: px

Starta visningen från sidan:

Download "Hemoglobinutredningar på Karolinska. Christin Sisowath Sjukhuskemist Karolinska Universitetslaboratoriet, Klinisk kemi"

Carina Göransson
för 7 år sedan
Visningar:

1 Hemoglobinutredningar på Karolinska Christin Sisowath Sjukhuskemist Karolinska Universitetslaboratoriet, Klinisk kemi

2 Analyser på Karolinska för hemoglobinutredningar Hemoglobinfraktioner HPLC (HbA 2 och HbF) Elektrofokusering (IEF) Hb, MCH och Ret He Masspektrometri PCR-RFLP Hb S Hb E Hb Lepore Hb Tacoma Sekvensering (HBA1, HBA2, HBB) α-thalassemi (α-globin Strip Assay) β-thalassemi (Klinisk genetik, Karolinska)

3 Hemoglobinfraktioner Vid utredning av hemoglobinvarianter och thalassemi Hemoglobinfraktioner innefattar Hemoglobin A 2 (α 2 δ 2 ) Hemoglobin F (α 2 γ 2 ) Elektrofokusering

4 HbA2 och HbF mäts kvantitativt med jonbyteskromatografi (HPLC) HbA 2 och HbF separeras från övriga hemoglobinfraktioner och elueras med saltgradient Eluatet passerar en flödescell och absorbansen mäts Ytan under topparna beräknas och svaret fås i % av totalt hemoglobin

5 HbA 2 Vuxna normalt: 2-3% av totala hemoglobinmängden Högre halt HbA 2 Heterozygot β-talassemi (β-thalassemia minor) ca dubblerad halt Vissa β-varianter, såsom HbS lätta stegringar Lätt sänkt halt HbA 2 α-talassemi järnbrist

6 HbF Vuxna normalt: <1% av totala hemoglobinmängden Högre halt HbF β -thalassemia major vid vissa genetiska tillstånd (hereditär persistens av HbF, HPFH) ibland vid β -thalassemia minor (lätt förhöjd) olika speciella sjukdomstillstånd

7 Elektrofokusering Elektrofokusering, IEF, för att utesluta tillstånd utan HbA 2 - ökning som fenotypiskt liknar heterozygot β -thalassemia (β -thalassemia minor), som t.ex. förekomst av Hb Lepore. Vi överväger att avstå från rutinmässig IEF

8 Hemoglobinfraktioner Utöver HPLC och elektrofokusering görs även Hb MCH (Hemoglobinmassa) Ret He (Retikulocythemoglobin equivalent) och ibland (Hb, instabilt)

9 masspektrometri Hemoglobinfraktioner

10 Masspektrometri Analys av Hb-fraktioner på masspektrometri utförs vid fall med oklar erytrocytos där elektrofokusering gett normalt resultat när elektrofokusering eller kromatografi inger misstanke om förekomst av hemoglobinvariant och man önskar kartlägga om α- eller β-variant

11 Masspektrometri Medelmassan av α- och β-globin kedjan förändras lika mycket som masskillnaden mellan den nya och den utbytta aminosyra Skillnaden i molekylmassan som uppstår vid utbyte av en aminosyra är mellan 0 till 129 Da. α-globin kedjan: Da β-globin kedjan: Da

12 Masspektrometri Samma masskillnad kan uppstå vid olika aminosyrautbyten Undersökning av intakt globin ger inte information om var i peptiden utbytet skett.

13 Masspektrometri Bedömningen av möjliga aminosyrautbyten med avseende på: Vilka som är förenliga med kända punktmutationer Utifrån variantens isoelektriska punkt, IEF

14 Hemoglobinfraktioner masspektrometri DNA-analyser: PCR-RFLP Sekvensering hybridisering

15 Hb S med PCR-RFLP I β-globinkedjan: glutaminsyra valin, aminosyraposition 6 För att skilja på homozygot Hb S och heterozygot Hb S och β-noll-thalassemi Vid misstänkt mönster vid elektrofokusering eller HPLC DNA analys

16 15* * 0 Fluorescence Hb S med PCR-RFLP Ej muterad HbS 201, 96, 89/88, 49/ /88, 49/ Htz kontr.hbs Time (seconds)

17 HbE med PCR-RFLP I β-globinkedjan: glutaminsyra lysin, aminosyraposition 26 För att skilja mellan homozygoti för HbE respektive kombination av heterozygoti för HbE och beta-noll-thalassemi i de fall där HbE är den helt dominerande hemoglobinformen. Vid misstänkt mönster vid elektrofokusering eller HPLC DNA analys

18 Hb Lepore med PCR-RFLP Samma fenotyp som heterozygot β-thalassemi (βthalassemia minor). Ingen HbA 2 -stegring 3 olika Hb Lepore: Hb Lepore Boston/Washington: δ-globin (aa 1-87) och β-globin (aa ) Hb Lepore Baltimore: δ-globin (aa 50) och β-globin (aa 86) Hb Lepore Hollandia: δ-globin (aa 22) och β-globin (aa 50)

19 Hb Lepore Boston/Washington med PCR-RFLP Del av -genen 417 bp Del av -genen Ingen PCR produkt bildas PVU II klyvningsställe Fusion av - och -generna Efter klyvning med PVU II 249 bp 166 bp

20 Hb Tacoma med PCR-RFLP Analys av HbA1c med HPLC patienten har minst 30% lägre nivå.

Hb Tacoma med PCR-RFLP I β-globinkedjan: arginin serin, aminosyraposition 30 1612 bp stort fragment

21 Hb Tacoma med PCR-RFLP I β-globinkedjan: arginin serin, aminosyraposition bp stort fragment amplifieras från β-globingenen Klyver med restriktionsenzymet Bsl I Vildtyp Tacoma

22 α-thalassemi Oftast större deletioner Multiplex-PCR (Tan et al, Blood Jul 1;98(1):250-1 ) α- globin strip assay (ViennaLab) 3 PCR reaktioner 2 hybridiseringsstrip

23 α-thalassemi α- globin strip assay (ViennaLab)

24 β-thalassemi Herlev Karolinska, Klinisk genetik Sekvensering och gap PCR enligt Chan et al (Am J Clin Pathol 2010;133: )

25 Sekvensering Alfaglobin HBA2 kodande delen av exon 1, 2 och 3 HBA1 exon 1, 2 och 3 Betaglobin: exon 1, 2 och 3

26 Erytrocytosutredning Lokalt intresse för familjär erytrocytos (högt Hb, ej PCV)

27 Utredning av högt Hb-värde S-EPO lågt normalt- högt ja JAK2 mutation nej Polycytemia vera EPO-receptorn Sekvensering av del av exon 8 Hb-variant VHL mutation: PCR-RFLP för Chuvash (Arginin tryptofan i aminosyraposition 200) Sekvensering av exon 1, 2 och 3 (kodande delen)

28 Sammanfattning Hemoglobinfraktioner HPLC (HbA 2 och HbF) Elektrofokusering (IEF) Hb, MCH och Ret He Masspektrometri PCR-RFLP Hb S Hb E Hb Lepore Hb Tacoma Sekvensering (HBA1, HBA2, HBB, VHL, EPOR) α-thalassemi (α-globin Strip Assay) inkl Hb Constant Spring β-thalassemi (Klinisk genetik, Karolinska)

29 TACK! Frågor? Maila

Relevanta dokument

Hemoglobinsjukdomar. Innehåll. R Zenlander & S Saltvedt

Hemoglobinsjukdomar. Innehåll. R Zenlander & S Saltvedt Hemoglobinsjukdomar Robin Zenlander Specialistläkare FO Klinisk kemi Sissel Saltvedt Överläkare PO Graviditet och förlossning Innehåll Introduktion Hemoglobinets normala struktur Thalassemi eller hemoglobinvariant?