Leukemier. Leukemier och genetik. Metoder inom cancergenetik. Varför genetisk diagnostik? Konventionell cytogenetik. Translokation

Transkript

1 Leukemier och genetik Leukemier Akut myeloisk leukemi (AML) Akut lymfatisk leukemi (ALL) Kronisk myeloisk leukemi (KML) Kronisk lymfatisk leukemi (KLL) Richard Rosenquist Brandell Klinisk genetik, Karolinska Solna Varför genetisk diagnostik? Diagnostisk/terapeutisk betydelse Prognostiska markörer (riskgruppering) Förbättra klassifikationer Följa klonal utveckling Följa minimal residual disease (MRD) Metoder inom cancergenetik Kromosomanalys FISH (fluorescens in situ hybridisering) DNA-baserade PCR/sekvensanalys RNA-baserade Kvalitativ/kvantitativ PCR Konventionell cytogenetik Material: blod, benmärg Odling krävs Antalet kromosomer: hypodiploidi hyperdiploidi Strukturella förändringar: translokationer inversioner deletioner Philadelphia kromosomen vid KML Translokation 46,XY,t(9;22)(q34;q11) 1

2 Inversion Deletion 46,XY,t(8;21)(q22;q22),del(9)(q1?3q22)[25] Leukemier - numeriska och strukturella avvikelser 54-55,XY,dup(1)(q21q32),+6,+10,+14,+18,+21,+3-7mar,inc[cp6]/46,XY[18] Fluorescens In Situ Hybridisering (FISH) Material: blod, benmärg, utstryk Analys kan ske av metafas- och interfas-kromosomer Riktad analys mot känd sekvens ger ökad upplösning Translokationer: BCR/ABL vid t(9;22) vid KML Fluorescens In Situ Hybridisering (FISH) Kromosom painting med kromosom-specifika prober Deletioner: Inversioner: Enskilda gener: del(17p) vid KLL inv(16) vid AML M4 MLL-genen vid AML M5 Multicolor-FISH (M-FISH) Paintar alla kromosomer 2

3 PCR Material: blod, benmärg, lymfkörtel Amplifiering av känd sekvens av DNA eller RNA (RT-PCR) Kvalitativ eller kvantitativ (realtids-pcr) BCR BCR-ABL mrna ABL Kvantitativ RT-PCR PCR Translokationer: Mutationer: Chimerismanalys: MRD-detektion: BCR/ABL FLT-3, NPM1 Mikrosatellitmarkörer BCR-ABL Annealing Extension Cleavage Chimerismanalys - kvantifiering av alleler med polymorfa markörer KML Philadelphiakromosomen Patient före BMT Givare Total DNA från patient efter BMT % 40-44% Total DNA från patient efter BMT 4 mån senare X Y KML Philadelphiakromosomen FISH BCR-ABL Interfas Metafas 3

4 Inhibition of BCR-ABL as therapy for terapi CML KML ett paradigm för genetiskt målriktad Kvantitativ RT-PCR för BCR-ABL 100,000 bcr-abl/abl x100 10,000 1,000 0,100 0,010 0, BCR-ABL/ABL % Känslighet ABL BCR-ABL/GUS % Resistens mot imatinib Utredningsgång KML Diagnos: Uppföljning: Kromosomer Ev FISH RT-PCR RQ-PCR var tredje månad Kromosomer varje år Ev mutationsanalys AML 2/3 uppvisar kromosomavvikelser Avvikelse FAB-typ % Gener Klinik Metod Pretreatment cytogenetic abnormalities are predictive of induction success, cumulative incidence of relapse, and overall survival in adult patients with de novo acute myeloid leukemia: results from Cancer and Leukemia Group B (CALGB 8461) Byrd et al, Blood AML patienter t(8;21) M RUNX1/CBFA2T1 lågrisk Cytogen, FISH t(15;17) M PML/RARA lågrisk FISH, RT-PCR inv(16) M4 5 CBFB/MYH11 lågrisk FISH 11q23-rearr M5 5 MLL högrisk cytogen, FISH inv(3) M1,M4,M6 1 högrisk cytogen Vanliga numeriska avvikelser: -5, -7 hög risk +8 intermediär/ogynnsam 4

5 Nyttan av cytogenetisk diagnostik vid AML Genetiska landskapet vid AML Standardrisk (10%) t(15;17), inv(16), t(8;21) Intermediärrisk (60%) Normal karyotyp Övriga avvikelser Ogynnsam risk (30%) -5, -7, inv(3), komplex karyotyp Chen et al, Nature Genetics 2013 FLT3, NPM-1 och CEBPA Prognostisk betydelse av FLT3 och NPM1 vid AML Mutationer i dessa gener är vanliga vid normal karyotyp FLT3-mutation/intern tandemduplikation (ITD) negativ markör FLT3-, NPM1+ NPM1-mutationer - positiv prognostisk markör CEBPA-mutationer - positiv prognostisk markör FLT3+, NPM1- Gale et al., Blood, AML-patienter WHO 2016 Hematologisk genetisk diagnostik vid AML Kromosomodling benmärg/blod Ev riktad FISH-analys t(8;21), t(15;17), inv(16)/t(16;16), MLL DNA-baserade analyser FLT3 / NPM1 CEBPA Genpanel planerar ersätta riktade analyser 5

6 ALL Pediatrisk ALL >2/3 har cytogenetika avvikelser Avvikelse Frekv. (%) Risk Metod Barn Vuxna t(1;19) 5 IR Cytogen, RT-PCR del(6q) 4 3 IR Cytogen. 11q23-rearr. 5 5 HR FISH, RT-PCR t(9;22) HR Cytogen, FISH, RT-PCR t(12;21) 20 2 SR? FISH, RT-PCR Hypodiploidi 3 HR Cytogen. Hög hyperdiploidi SR Cytogen. Överlevnad i relation till cytogenetisk subgrupp vid ALL hos vuxna WHO 2008 Moorman et al, Blood 2007 Hematologisk genetisk diagnostik vid ALL Kromosomodling benmärg/blod Riktad FISH-analys Vuxna: t(9;22), MLL (11q23) Barn och vuxna upp till 45 år: t(9;22), MLL, t(12;21), t(1;19), del(9p) Viktiga prognostiska faktorer vid KLL Prognostiska faktorer Låg risk Hög risk Kliniskt stadium Binet A Rai 0/I Binet B/C Rai II, III, IV IGHV-mutationsstatus Muterad Omuterad Genetiska abnormaliteter Normal,13q- 11q-, 17p-, trisomi 12 6

7 KLL-FISH och TP53 mutationsstatus Mutationsstatus av immunoglobulin-genen vid KLL Muterad 55% Medianöverlevnad 293 mån KLL-FISH TP53 screening (exons 2-11) Omuterad 45% Medianöverlevnad 117 mån Döhner et al, N Engl J Med 2000 Zenz et al, Nature Reviews 2010 Hamblin et al. Blood 1999 Utredning: FISH (utstryksglas) del(13q) del(11q) del(17p) trisomi 12 KLL Mutationsstatus TP53-genen Ev Mutationsstatus immunglobulin(ig)-genen Nya möjligheter Med next-generation sequencing kan vi: Analysera många gener samtidigt (genpaneler) Analysera alla kodande gener (exomsekv.) Hela genomet hos en individ (helgenomsekv.) Öppnar möjlighet att avsevärt kunna förbättra cancerdiagnostik och diagnostik av ärftliga sjukdomar. Hematologi: NGS-baserade test Utvecklar genpaneler för: Myeloida maligniteter Lymfoida maligniteter RNA-sekvensering: Detektion av fusionstranskript Exomsekvensering av behandlingsresistenta patienter Helgenomsekvensering: SNV/indels, strukturella aberrationer 7