DNA-labb / Plasmidlabb

HTML
DOWNLOAD

Storlek: px

Starta visningen från sidan:

Download "DNA-labb / Plasmidlabb"

Erika Lundström
för 9 år sedan
Visningar:

1 Översikt DNA-labb Plasmidlabb Preparation och analys av -DNA från Escherichia coli Varför är vi här idag? Kort introduktion till biokemi och rekombinant DNA- teknologi Vad skall vi göra idag? Genomgång av protokollet Hur skall vi lära oss något? Genomgång av hur resultaten analyseras. Biokemi och biofysik Vi försöker få molekylär förståelse för biologiska system. Ex: DNARNA, proteiner, små molekyler (ATP). En viktig del är proteiners funktion och struktur. Varför? Både akademi och industri. Grundforskning; fundamentala frågor. Koppling till fysiologiska tillstånd. Läkemedel. Bakterier vad har de med oss att göra? Ger oss sjukdomar, men vi klarar oss inte utan dem. Senaste decennierna: Bakterier är i vår tjänst som proteinfabriker. Plasmid-DNA Kan modifieras av oss och tas upp av bakterien. Möjligt att göra förändringar i proteinet, byta ut aminosyror. Produktion av det protein som en kodar för. Vanlig bakterie för produktion av proteiner: Escherichia coli Finns naturligt i magtarmkanalen Vissa varianter kan orsaka diarre & urinvägsinfektion Enkel att jobba med, växer snabbt Enkel att modifera etiskt, er Uttrycker stora mängder protein Några bilder av E. coli Medsols, från ö.v: Odling på platta; elektronmikroskopi (EM); om; EM, tillsammans med Bacillus megaterium. 1

Ex: DNARNA, proteiner, små molekyler (ATP). En viktig del är proteiners funktion och struktur. Varför? Både akademi och industri. Grundforskning; fundamentala frågor.

2 Från DNA till protein Vad ska vi göra idag? Transkription: En i DNA-molekylen skrivs om till RNA. Isolera och analysera -DNA från E. coli om att: Translation: I ribosomen byggs ett protein upp efter RNA-ritnin. Extrahera -DNA från E.coli celler Klyva en med restriktionsenzymer Analysera de kluvna fragmenten med agarosgelelektrofores Vad är er? er är en sorts DNA-molekyler som är separata från bakteriens e kromosom cirkulära och icke-essentiella (inte nödvändiga för bakteriens överlevnad) små -några tusen baspar långa -fåtal er när vi använder dem innehåller en (oftast): - som kodar för det protein vi vill ha -er som kodar för antibiotikaresistens men er finns också naturligt i bakterier Klonakopiera en PCR (Polymerase Chain Reaction). Klyv en Restriktionsenzymer (så att en kan sättas in i en). Ligera (klistra ihop) ihop fragmenten Enzymet Ligas Sätt in en med en i en bakterie Analysera Hur uttrycker man ett främmande protein i en bakterie? Rätt med rätt i bakterien? Vi måste isolera en och analysera den. Först: Innehåller alla bakterier i odlin en? Ja! Bakterien växer i närvaro av antibiotikan ampicillin, och i en finns en som kodar för antibiotikaresistens. Alltså: Bara de bakterier som har en överlever......men sitter en vi vill titta på i en? Känner i och klyver DNA specifika symmetriska sekvenser Restriktionsenzymer Finns i bakterier försvar mot främmande DNA (virus). Ger upphov till, a) blunt ends (ex AluI) b) sticky ends (ex BamHI) 2

coli celler Klyva en med restriktionsenzymer Analysera de kluvna fragmenten med agarosgelelektrofores Vad är er?

Vandringssträcka (mm) 2012-04-27 Agarosgelelektrofores Agaros Socker från alger som bildar polymer så att gelen stelnar Hur ska vi kunna se vårt DNA?

Dessutom: Kan ta sig iom cellmembran. Ladda proverna i varsin brunn. DNA har en nettoladdning på minus. Lägg på elektrisk spänning. DNA:t kommer att vandra mot pluspolen.

3 Vandringssträcka (mm) Agarosgelelektrofores Agaros Socker från alger som bildar polymer så att gelen stelnar Hur ska vi kunna se vårt DNA? Traditionellt: etidiumbromid Etidiumbromid binder till DNA fluorescerar i UV-ljus starkare när det är bundet till DNA Major groove MEN: Etidiumbromid är mycket mutat och binder till allt DNA! Dessutom: Kan ta sig iom cellmembran. Ladda proverna i varsin brunn. DNA har en nettoladdning på minus. Lägg på elektrisk spänning. DNA:t kommer att vandra mot pluspolen. Efter ca 45 minuter har DNA-fragmenten rört sig lagom långt om gelen. Därför använder vi GelRed, en molekyl (hemlig struktur) med liknande fluorescenseskaper, men passerar inte cellmembran. Vi blandar GelRed direkt i agarosgelen. Hur ska vi kunna analysera vårt DNA? Referens DNA-stege DNA-fragment med kända storlekar körs bredvid prov se ungefärlig storlek av vårt DNA DNA-storlek anges i baspar (bp) eller i kilobaspar (Kb) Labben - A B Storleks Referens Utförande + Plasmidprepp dvs isolering av P1 1 Skaka 2 Buffert Tillsätts i ett eppendorf rör med E. coli RNAser RNA bryts ner Centrifugera Sup Pellet 3 4 Pellet av bakterier som innehåller en 3

4 P2 Lyseringsbuffert NaOH, Natriumhydroxid Basiskt Sodium Dodecyl Sulfat Löser upp membranet Tillsätt P2 i eppendorfröret som innehåller E. Coli och P1. Blanda! Ättiksyra Neutraliserar ph Salt N3 Fäller ut proteiner, omiskt (E. colis eget) DNA och det nedbrutna RNAt från P1 Tillsätt N3 i eppendorfröret som innehåller E. Coli, P1 och P2. Blanda! Centrifugera Balansera rören Flera grupper kör tillsammans Separera en Spara supernatant (Sup) = lösnin ovanpå DÄR FINNS PLASMIDEN! Pellet = det fasta i botten (Vit) Fällda proteiner Genomiskt DNA Nedbrutet RNA Tvätta kolonnens filter Centrifugera kolonnen Plasmiden fastnar i filtret i kolonnen Släng vätskan som gått iom Buffert PB Tvättar bort proteiner Släng vätskan som gått iom Buffert PE Tvättar bort salt Släng vätskan som gått iom Eluera en Vatten (för eluering) Byt kolonnens uppsamlings rör till ett nytt eppendorf rör med lock Tillsätt vatten och låt ståinkubera 1 min Plasmiden finns nu i eppendorfröret, löst i vatten. SPARA DENNA LÖSNING! 4 mikroliter (ml) eluerad förs över till restriktionsenzym-mixer A, B och C Inkubera 5 minuter i vattenbad Klyvning av en 4

Centrifugera Balansera rören Flera grupper kör tillsammans Separera en Spara supernatant (Sup) = lösnin ovanpå DÄR FINNS PLASMIDEN!

5 Klyvning av -DNA 5 AGATCT3 3 TCTAGA5 Klyvning av -DNA 5 GAATTC3 3 CTTAAG5 Restriktionsenzym-mix A, : Restriktionsenzym-mix B, : Klyvning av -DNA 5 AGATCT3 3 TCTAGA5 5 GAATTC3 3 CTTAAG5 Analys med agarosgelelektrofores Restriktionsenzym-mix C, och : Tillsätt provpåsättningsbuffert Analysera med gelelektrofores. Fluorescerande band i UV ljus är GelRed bundet till DNA Foto av gelen Stege med kända storlekar av DNA Jämför era band med stes band. A B C DNAstege DNAstegemall Separerar DNA fragment med avseende på storlek. 5

provpåsättningsbuffert Analysera med gelelektrofores.

Relevanta dokument

LAB 12. Preparation och analys av plasmid-dna från E.coli

LAB 12. Preparation och analys av plasmid-dna från E.coli Institutionen för biokemi och biofysik LAB 12 Preparation och analys av plasmid-dna från E.coli Basåret 2012 (finns på basårshemsida: www.kemi.su.se, välj Basår) INTRODUKTION I denna laboration ska vi