Molekylär bioteknik. Vad är en gen? Molekylärbiologiska verktygslådan. Eukaryot transkription/translation. Prokaryot transkription/translation

Transkript

1 Molekylär bioteknik Föreläsning 1 Molekylär Bioteknik 2008 Molekylärbiologi Mikrobiologi Biokemi enetik Kemiteknik ellbiologi ransgena djur -växter -djur Diagnostik -genetisk predisposition -detektion av patogener Molekylär bioteknik Förståelse av cellbiologi -signalöverföring -differentiering -celldöd Rekombinant proteinproduktion -terapeutika -diagnostik -vaccin Förståelse av sjukdomar -infektiösa: IV, epatitis -genetiska: cancer, lzheimer, F promotorer Vad är en gen? transkriptionsstart RBS gen signalpeptid transkriptionsterminering Prokaryot transkription/translation RN polymeras P strukturell gen transkriptionsenhet ribosomer polycistront mrn proteiner -operon -kopplad transkription/translation (cytopl.) Eukaryot transkription/translation Molekylärbiologiska verktygslådan P primärt mrn (monocistront) ap ap ap exon protein intron transkription processning splicing export translation cellkärnan cytoplasman Enzymer PR ransformering -restriktionsenzymer -heat-shock In vitro mutagenes -ligaser -elektroporering -DN-polymeraser -omvänt transkriptas (R) -kinaser Vektorer -plasmider -fager (M13, ) -partikelbombardemang -mikroinjektion -transfektering -polynukleotidtransferaser -cosmider Selektionsmetoder -fosfataser -Ys -antibiotika resistens -virus Oligonukleotidsyntes -genetisk komplementering -primers Värdceller Screeningmetoder -prober -bakterier -genotypisk -gene assembly -jäst/svampar -fenotypisk DN sekvenering -växtceller -insektsceller -Maxam-ilbert -mammalieceller -Sanger -pyrosekvenering 1

2 Enzymer Restriktionsenzymer Specifika DN-sekvenser (4-8bp) känns igen och klyvs av restriktionsenzymer Igenkänningssekvensen (RS) är ofta en palindrom, d v s kan läsas från båda håll Specifika metylaser metylerar baser i RS varmed bakteriens eget DN skyddas från klyvning EcoRV EcoRI PstI blunt end sticky ends Restriktionsenzymer Restriktionsenzymer Ligaser Ligaser återskapar fosfodiesterbindningar genom att -fosfatgruppen förenas med fria -hydroxylgruppen. Ett vanligt använt ligas är 4-DNligas. Ligaser används för att klistra ihop DN-fragment med varandra. -O -P P- O- + 4-DNligas, P -O -P P- O- + 4-DNligas, P DN-polymeraser DN-polymeraser inkorporerar deoxynukleotider (dnps) till en växande DN-kedja genom att addera dessa dnps till den fria - O-gruppen på kedjan med motstående DN-sträng som templat. Några vanligt använda polymeraser är DN-polymeras I samt 7- DN polymeras. De används bl a för att: -generera blunt-ends -vid sekvensreaktioner kan återklyvas med BamI (-ˇ-) kan ej återklyvas med BamI (-ˇ-) + dnps, polymeras 2

3 Omvänt transkriptas (R) Omvänt transkriptas (R) syntetiserar en komplementär DNsträng utifrån ett RN-templat. Retrovirus (ex IV) använder denna mekanism för att göra en DN-kopia av sitt RN-genom. ekniskt användningsområde: -utnyttjas i ett steg då man vill göra cdn. mrn ap mrn cdn ap omvänt transkriptas + dnps erminaltransferas erminaltransferas adderar nukleotider till -änden av DNkedjor. De används bl a för att generera kohesiva ändar från blunt-end fragment och vid cdn-syntes. dp + dp terminaltransferas -O O- ligering Fosfataser och kinaser Fosfataser tar bort fria -fosfatgrupper från DN -används för att minimera bakgrundsligering av självligerad vektor vid kloningsförsök -vanliga fosfataser är shrimp- samt bovine alkaline phosphatase DN- sekvenering Kinaser adderar fosfatgrupper till änden av DN -används för att fosforylera syntetiskt DN (ex linkers) före ligering till vektor -polynukleotidkinas (PNK) Maxam-ilbert-sekvenering Sanger-sekvenering dubbelsträngat DN märk med 32-P klyv med RE + + preparera enkelsträngat DN selektiv kemisk degradering av specifika baser märkt oligonukleotid ssdn + DN-polymeras + dnps + ddp + ddp + ddp + ddp Sangers dideoxymetod P P P O 2 3 Bas O 2,-dideoxyanalog 3

4 Pyrosekvenering Light intensity is proportional to the number of nucleotides incorporated PR 2x LI Photomultiplication on D camera ddition order... PR (Polymerase chain reaction) DN-templat 94 separation av DN-strängarna annealing av specifika primers Mutagenes 72 extension (värmestabilt aq polymerase) 72 Upprepa cykler exponentiell ökning av mängden produkt In vitro mutagenes Riktad mutagenes Exempel: Ser yr Denaturera och hybridisera med mutant oligonukleotid Riktad mutagenes Studera effekter av enstaka mutationer Slumpmässig mutagenes Screena/selektera för intressanta mutationer Komplementära, syntetiska oligonukleotider med den önskade mutationen: DN-polymeras + DNligas ransformera bakterier 4

5 Vektorer Plasmider Plasmider är cirkulärt extrakromosomalt DN De används som vektorer = bärare av främmande DN -utnyttjas för detta ändamål vid kloning och proteinexpression -insert 5 kb Plasmidvektorer innehåller generellt: -ori (origin of replication) -gen/er för selektion (ofta antibiotikaresistens) -multikloningssite -ibland gen för screening (t ex lacz för blå-vit screening) Olika typer av plasmidvektorer har olika copy nr Plasmider tillhör olika inkompatibilitetsgrupper. vå olika vektorer tillhörande samma inkompatibilitetsgrupp kan ej propageras samtidigt i en och samma värdcell. Bakteriofag Bakteriofag Bakteriofag är ett virus som infekterar bakterier (E. coli). -de kan ha en lytisk och en lysogen fas. -de har ett genom om ca 45 kb, varav en central region, omfattande ca 15 kb, ej behövs för dess replikation. -i vardera ände av genomet finns enkelsträngade komplementära kohesiva ändar (OS-sites). Dessa utnyttjar fagen för att göra konkatamerer av sitt genom inför packning i fagpartiklar. -genomet har modifierats så att det passar som vektor. Bl a har unika sites introducerat på vardera sida om den centrala regionen, vilka kan utnyttjas för att ersätta denna med främmande DN. -insert måste ha en storlek om ca 15 kb, annars kan infektiösa fagpartiklar ej packas. används för kloning av genomiska fragment, eftersom plasmider inte lämpar sig som bärare av större fragment. osmider osmider är hybrider av plasmider och fager. De innehåller: -ori -gen för antibiotikaresistens (ex et) -cos-sites -kloningsites osmider utnyttjas för kloning av genomiskt DN när större fragment än 15 kb används (gränsen för vad lambda kan härbärgera). De kan bära ca 45 kb insert. cos antibiotika-resistens gen genomiskt DN vektor DN (cosmid) Yeast artificial chromosome (Y) Ys innehåller: -autonomously replicating sequence (RS) från jästkromosom -centromer (EN), vilken bidrar till stabil fördelning av Ys mellan moder- och dotterceller -två telomerer, vilka fungerar som kromosomändar och därmed möjliggör replikation av Ys i form av små linjära kromosomer. -selekterbara markörgener, ex LEU2 vilken komplementerar Leunegativa stammar. -kloningsites Ys används för kloning av mkt stora genomiska DNfragment ( kb) telomer LEU2 RS EN jäst DN telomer 50 kb 5

6 Värdceller Värdceller Olika vektorer används för att introducera rekombinant DN i olika typer av värdceller, t ex: Bakterier - E. coli är vanligast - öga expressionsnivåer - Möjlighet till storskalig produktion. Jäst Insektsceller Däggdjursceller Växtceller Eukaryota celler Post-translationella modifieringar (t ex glykosylering) möjliga Selektionsmetoder - ampicillin - carbenicillin - kloramfenikol - tetracyklin - kanamycin ntibiotika-resistens Vanliga antibiotika inom molekylärbiologi: Inhiberar syntes av cellväggen Inhiberar proteinsyntes Klonad gen Plasmid ransformera bakterier med ligerad plasmid Sprid ut bakterierna och låt växa på agar-platta med antibiotika Endast bakterier som tagit upp plasmid med antibiotika-resistens överlever och ger upphov till kolonier enotypisk screening en för antibiotikaresistens Screeningmetoder Probhybridisering känd nukleotidsekvens 15 nukleotiders prob okänd nukleotidsekvens guessmer, ca 50 nukleotider (unik) Längre pga risk för mismatch degenererad prob, ca 17 nukleotider baserad på aa-sekvens (6 st) 6

7 Fenotypisk screening Blå-vit screening EcoRI site ktivitets-screening ex. proteasaktivitet (subtilisin) odling på kasein-medium klart område runt koloni Immunoscreening antikropp mot proteinet ransformera bakterier och odla på agar-plattor med ampicillin och X-gal O N LacZ mp R Kloning av ett fragment i EcoRI sitet förstör LacZ, som kodar för enzymet -galaktosidas - endast bakterier som har tagit upp plasmid är resistenta mot ampicillin och kan växa - bakterier utan klonat fragment har funktionellt -galaktosidas och bildar en blå produkt av substratet X-gal O O O O O l X-gal Br - bakterier med klonat fragment saknar funktionellt -galaktosidas och bildar vita kolonier 7