Föreläsningens innehåll. Rekombinanta läkemedel. Genterapi. 7 november 2008 Sissela Liljeqvist

Transkript

1 Föreläsningens innehåll Rekombinanta läkemedel och Genterapi 7 november 2008 Sissela Liljeqvist sissela@liljeqvist.se Rekombinanta proteiner Enzymer Monoklonala antikroppar Produktion av rekombinanta antikroppar i E. coli Nukleinsyror som potentiella läkemedel RNA RNA-DNA Genterapi virusvektorer icke-virala metoder Prodrug activation Rekombinanta läkemedel Rekombinanta läkemedel rekombinant insulin lanserat 1982 nu över 165 st. rekombinanta läkemedel på marknaden fviii, fviia, fix, hgh, FSH, EPO, tpa, INF-,-,-, PDGF, diverse mab, m.fl. 750 kandidater i kliniska prövningar se tab. 10:1

2 Generella principer Modifiering av proteiner Identifiering av protein genetisk kod klona till värdorganism expressionsvektor produktion och rening av protein Interferoner: blanda delar av gener från olika IFN- hgh: punktmutationer för att byta aa och minska bindning till Zn 2+ (minskad affinitet för prolaktinreceptor) TNF- : targeting peptide 6 aa stor Optimering av genexpression och delivery L. lactis värdorganism nativt protein glykosyleringar hela bakterier som uttrycker rekombinant protein ex. L. lactis IL-10

3 ENZYMER Behandling mot cystisk fibros: DNAse I variant med minskad aktinbindning Alginate lyase ENZYMER (forts.) Phenylalanin ammonia lyase PKU: brist på fenylalanin-hydroxylas kapslat enzym ges oralt 1 -antitrypsin antiviralt Antikroppar som läkemedel Antikroppar som läkemedel Immunoglobulin G passiv immunisering: monoklonala antikroppar (mab) chimeric mab hästantikroppar mot difteri Gammaglobulin (IgG) mot hepatit A

4 Antikroppar: struktur Fv Framställning av monoklonala antikroppar CDR1 CDR2 CDR3 Fab Fc Monoklonala antikroppar förhindra avstötning av transplantat behandling av hjärntumörer behandling av bröstcancer Monoklonala antikroppar mot RSV-infektion hos barn behandling av kroniska inflammationssjukdomar, tex. Crohns sjd, rematoid artrit

5 Targeting aktiva substansen når inte målcellerna med tillräckligt hög koncentration åtgärd: targeting (liposomer) (toxingener i tumörinflitrerande lymfocyter) koppling till monoklonal antikropp (mab) enzym som omvandl prodrug till drug kopplad till mab Humana monoklonala antikroppar human myeloma cell-linje finns ej försök med immunisering av människor oetiska mänskliga stamceller i SCID-möss transgena möss: humana Ig-gener (sedan standard hybridoma-metoder) Human-Mouse monoclonal antibodies chimeric antibody humanized antibody Producera antikroppar i E.coli? borde vara billigare MUS HUMAN generna kodande för CDR1, CDR2, CDR3 är från musmonoklonala antikroppar. kombineras med gener för humant IgG selektion- det svåra! produktion

6 Phage display Fag-bibliotek cdna från humana B-celler syntetiseras H- och L-sekvenser amplifieras med PCR, klonas i bakteriofag -vektor H- och L-kedjor uttrycks under fagens lytiska cykel bibliotek av kombinatoriska kloner screening för antigenbindning subkloning i E.colivektor, uttryck i E.coli av Fv-fragment Filamentous bacteriophages Kombinatoriskt bibliotek av antikroppsfragment VL och VH cdna amplifieras med PCR ligering med linker och sätts in i gen 3 packas i fag M13 V L single-chain antibody på ytan V H

7 Nukleinsyror som läkemedel Antisense (DNA-bindare - antigen-oligonukleotid) RNA-bindare - antisense-rna RNA-bindare - antisense-oligonukleotid (dsdna-oligonukleotider som binder enzymer) ribozym RNA-DNA-komplex RNAi RNA gen transkriberas till RNA RNA binder mål-rna X oligonucleotide binder mål-rna modifierade nukleotider fosforotioatbindning peptide nucl. acid X Ribozymer katalytiska RNA-molekyler hammarhuvud hårnål kemisk modifiering: injektion, liposomer virus RNA-DNA-molekyler ribonukleotider och deoxyribonukleotider dubbel hårnålsformation metylering av syre på 2 -kolet i ribos central komplementär region, med en mismatch korrigerar punktmutation T T T T 3 5 T T T T

8 interfererande RNA RNAi skyddar växter och djur från virus? nukleas binds till dsrna dsrna klyvs och dissocierar till ssrna ssrna-nukleas binder till mrna, som klyvs GENTERAPI Exempel på ärftliga sjukdomar: 7000 kända monogena sjukdomar defekter i metabolism Gauchers sjukdom Fenylketonuri felaktigt strukturellt protein hemofili A (blödarsjuka)

9 Behandling av ärftliga sjukdomar specialdiet inhibering av enzymer ta bort toxiska ämnen ersättning av saknat/felaktigt ämne förändring av felaktigt ämne transplantation genterapi Genterapi tillförsel av en funktionell gen till en mänsklig cell för att korrigera en gendefekt somatiska celler (ej germ line cells ) 1990 första människo-genterapi-försöket virala vektorer icke-virala metoder Kliniska försök med genterapi ingen dokumenterad behandlingseffekt studier i gene delivery, expression etc 368 kliniska försök (se tab. 10.5) säker metod fram till hösten dödsfall Frågeställningar hur nås målcellerna? hur ska genen levereras? hur stor del av målcellerna måste transfekteras? hur ska transkriptionen regleras? kommer nya genen behållas av cellen och transkription bli livslång?

10 Selektiv expression i målceller Isolering av målceller + gene delivery målsökande vektor Genöverförings-tekniker Icke-biologiska metoder Liposomer och poly-katjoner (lipofection) Elektroporering In situ naked-dna injektion Gene gun (DNA-coatade guldpartiklar) selektiv expression Biologiska metoder Transduktion (virus-medierad överföring) Promoter Suicid / toxisk gene DNA i främmande cell Liposom-DNA complex (lipoplex) Ingen begränsning i storlek på DNA Episomal Expression under kort tid Många olika målcellstyper Instabilt in vivo Integration i kromosom Episom

11 Receptor-medierat upptag Förbättring av receptor-medierat upptag Kärna Endosom Lysosom [H + ] poly-l-lysin länkat till bindningsmolekylen DNA binds till + laddat polylysin toroid peptider som ökar cellspecifik bindning, membranfusion och internalisation av DNA peptider som stabiliserar DNA och underlättar inträde i kärnan Human artificial chromosomes ligering av kromosomala byggstenar: centromer, ori, telomer, diverse gener Deletion av material från en ursprunglig kromosom: trunkering in situ bildar minikromosom Odlade celler vävnadsspecifika celler som transfekterats och odlats upp i cellkultur celler inkapslade i semipermeabelt membran implanteras immunsystemet ser inte de inkapslade cellerna proteiner produceras

12 Retrovirala vektorer Rekombinanta retroviruspartiklar Storlek på insert 7-8 kb Slumpmässig kromosomal integration Endast integrering i prolifererande celler Expression under kort eller lång tid Olika värdceller Svårt att producera i stor skala Immunogena cell-linje med strukturella virusgener produktion av virusproteiner transfektion med vektor-rna med packningssignal viruspartiklar sätts ihop innehåller vektor-rna som packats i partiklarna Prodrug activation therapy: HSV thymidinkinas- Ganciclovir HSVtk P Endogenous enzyme P P P Sammanfattning Rekombinanta proteiner Enzymer Monoklonala antikroppar Bakteriofag-system Nukleinsyror som potentiella läkemedel RNA RNA-DNA Genterapi virusvektorer icke-virala metoder Prodrug activation