Rekombinanta läkemedel och Genterapi

Transkript

1 Rekombinanta läkemedel och Genterapi 9 november 2007 Sissela Liljeqvist sissela@liljeqvist.se

2 Föreläsningens innehåll Rekombinanta proteiner Enzymer Monoklonala antikroppar Produktion av rekombinanta antikroppar i E. coli Nukleinsyror som potentiella läkemedel RNA RNA-DNA Genterapi virusvektorer icke-virala metoder Prodrug activation

3 Rekombinanta läkemedel

4 Rekombinanta läkemedel rekombinant insulin lanserat 1982 nu över 80 st. rekombinanta läkemedel på marknaden fviii, fviia, fix, hgh, FSH, EPO, tpa, INF-α,-β,-γ, PDGF, diverse mab, m.fl. 750 kandidater i kliniska prövningar se tab. 10:1

5 Generella principer Identifiering av protein genetisk kod klona till värdorganism expressionsvektor produktion och rening av protein

6 Modifiering av proteiner Interferoner: blanda delar av gener från olika IFN-α hgh: punktmutationer för att byta aa och minska bindning till Zn 2+ (minskad affinitet för prolaktinreceptor) TNF-α: targeting peptide 6 aa stor

7 Optimering av genexpression och delivery värdorganism nativt protein glykosyleringar hela bakterier som uttrycker rekombinant protein ex. L. lactis IL-10

8 L. lactis

9 ENZYMER Behandling mot cystisk fibros: DNAse I variant med minskad aktinbindning Alginate lyase

10 ENZYMER (forts.) Phenylalanin ammonia lyase PKU: brist på fenylalanin-hydroxylas kapslat enzym ges oralt α 1 -antitrypsin antiviralt

11 Antikroppar som läkemedel Immunoglobulin G monoklonala antikroppar (mab) chimeric mab

12 Antikroppar som läkemedel passiv immunisering: hästantikroppar mot difteri Gammaglobulin (IgG) mot hepatit A

13 Antikroppar: struktur Fv CDR1 CDR2 CDR3 Fab Fc

14 Framställning av monoklonala antikroppar

15 Monoklonala antikroppar förhindra avstötning av transplantat behandling av hjärntumörer behandling av bröstcancer

16 Monoklonala antikroppar mot RSV-infektion hos barn behandling av kroniska inflammationssjukdomar, tex. Crohns sjd, rematoid artrit

17 Targeting aktiva substansen når inte målcellerna med tillräckligt hög koncentration åtgärd: targeting (liposomer) (toxingener i tumörinflitrerande lymfocyter) koppling till monoklonal antikropp (mab) enzym som omvandl prodrug till drug kopplad till mab

18 Humana monoklonala antikroppar human myeloma cell-linje finns ej försök med immunisering av människor oetiska mänskliga stamceller i SCID-möss transgena möss: humana Ig-gener (sedan standard hybridoma-metoder)

19 Human-Mouse monoclonal antibodies chimeric antibody humanized antibody MUS HUMAN generna kodande för CDR1, CDR2, CDR3 är från musmonoklonala antikroppar. kombineras med gener för humant IgG

20 Producera antikroppar i E.coli? borde vara billigare selektion- det svåra! produktion

21 Fag-bibliotek cdna från humana B-celler syntetiseras H- och L-sekvenser amplifieras med PCR, klonas i bakteriofag λ-vektor H- och L-kedjor uttrycks under fagens lytiska cykel bibliotek av kombinatoriska kloner screening för antigenbindning subkloning i E.colivektor, uttryck i E.coli av Fv-fragment

22 Filamentous bacteriophages Kombinatoriskt bibliotek av antikroppsfragment VL och VH cdna amplifieras med PCR ligering med linker och sätts in i gen 3 packas i fag M13 V L single-chain antibody på ytan V H

23 Nukleinsyror som läkemedel (DNA-bindare - antigen-oligonukleotid) RNA-bindare - antisense-rna RNA-bindare - antisense-oligonukleotid (dsdna-oligonukleotider som binder enzymer) ribozym RNA-DNA-komplex RNAi

24 Antisense RNA gen transkriberas till RNA RNA binder mål-rna X oligonucleotide binder mål-rna X modifierade nukleotider fosforotioatbindning peptide nucl. acid

25 Ribozymer katalytiska RNA-molekyler hammarhuvud hårnål kemisk modifiering: injektion, liposomer virus

26 RNA-DNA-molekyler ribonukleotider och deoxyribonukleotider dubbel hårnålsformation metylering av syre på 2 -kolet i ribos central komplementär region, med en mismatch korrigerar punktmutation T T T T 3 5 T T T T

27 interfererande RNA RNAi skyddar växter och djur från virus? nukleas binds till dsrna dsrna klyvs och dissocierar till ssrna ssrna-nukleas binder till mrna, som klyvs

28

29 GENTERAPI Deshaies 02 Colored human chromosomes #1

30 Exempel på ärftliga sjukdomar: 7000 kända monogena sjukdomar defekter i metabolism Gauchers sjukdom Fenylketonuri felaktigt strukturellt protein hemofili A (blödarsjuka)

31 Behandling av ärftliga sjukdomar specialdiet inhibering av enzymer ta bort toxiska ämnen ersättning av saknat/felaktigt ämne förändring av felaktigt ämne transplantation genterapi

32 Genterapi tillförsel av en funktionell gen till en mänsklig cell för att korrigera en gendefekt somatiska celler (ej germ line cells ) 1990 första människo-genterapi-försöket virala vektorer icke-virala metoder

33 Kliniska försök med genterapi ingen dokumenterad behandlingseffekt studier i gene delivery, expression etc 368 kliniska försök (se tab. 10.5) säker metod fram till hösten dödsfall

34 Frågeställningar hur nås målcellerna? hur ska genen levereras? hur stor del av målcellerna måste transfekteras? hur ska transkriptionen regleras? kommer nya genen behållas av cellen och transkription bli livslång?

35 Selektiv expression i målceller Isolering av målceller + gene delivery målsökande vektor selektiv expression Promoter Suicid / toxisk gene

36 Genöverförings-tekniker Icke-biologiska metoder Liposomer och poly-katjoner (lipofection) Elektroporering In situ naked-dna injektion Gene gun (DNA-coatade guldpartiklar) Biologiska metoder Transduktion (virus-medierad överföring)

37 DNA i främmande cell Integration i kromosom Episom

38 Liposom-DNA complex (lipoplex) Ingen begränsning i storlek på DNA Episomal Expression under kort tid Många olika målcellstyper Instabilt in vivo

39 Receptor-medierat upptag Endosom [H + ] Kärna Lysosom

40 Förbättring av receptor-medierat upptag poly-l-lysin länkat till bindningsmolekylen DNA binds till + laddat polylysin toroid peptider som ökar cellspecifik bindning, membranfusion och internalisation av DNA peptider som stabiliserar DNA och underlättar inträde i kärnan

41 Human artificial chromosomes ligering av kromosomala byggstenar: centromer, ori, telomer, diverse gener Deletion av material från en ursprunglig kromosom: trunkering in situ bildar minikromosom

42 Odlade celler vävnadsspecifika celler som transfekterats och odlats upp i cellkultur celler inkapslade i semipermeabelt membran implanteras immunsystemet ser inte de inkapslade cellerna proteiner produceras

43 Retrovirala vektorer Storlek på insert 7-8 kb Slumpmässig kromosomal integration Endast integrering i prolifererande celler Expression under kort eller lång tid Olika värdceller Svårt att producera i stor skala Immunogena

44 Rekombinanta retroviruspartiklar cell-linje med strukturella virusgener produktion av virusproteiner transfektion med vektor-rna med packningssignal viruspartiklar sätts ihop innehåller vektor-rna som packats i partiklarna

45 Prodrug activation therapy: HSV thymidinkinas- Ganciclovir HSVtk P Endogenous enzyme P P P

46 Sammanfattning Rekombinanta proteiner Enzymer Monoklonala antikroppar Bakteriofag-system Nukleinsyror som potentiella läkemedel RNA RNA-DNA Genterapi virusvektorer icke-virala metoder Prodrug activation