Analyser av biologiska läkemedel (med fokus på anti-tnf antikroppar) Per Marits ST-kurs i Allergi och Autoimmunitet 5:e oktober 2016

Transkript

1 Analyser av biologiska läkemedel (med fokus på anti-tnf antikroppar) Per Marits ST-kurs i Allergi och Autoimmunitet 5:e oktober 2016

2 Biologiska läkemedel Biological medicinal product, biologicals Framställda genom biologiska processer; inte kemiskt syntetiserade Några huvudgrupper: 1) Rekombinant framställda kopior av kroppsegna proteiner, t ex insulin, tillväxthormon, interleukin-2 2) Monoklonala antikroppar 3) Lösliga receptorer; fusionsproteiner 4) Vacciner 5) Genterapi

3 Immunogenicitet Biologiskt Läkemedel TH B B HLA II Cytokiner CD40-CD40L Antigen-presentation för CD4+ T hjälparceller Y Y Antikroppar mot läkemedlet

4 Potentiella konsekvenser för patienten Utebliven behandlingseffekt Infusionsreaktioner Autoimmunitet

5 Drug target Läkemedelskoncentration Antikroppsbildning mot läkemedlet

6 Anti-TNF läkemedel Tracey, D. et al. (2008). Pharmacol. Therap.

7 TNF biologi Tracey, D. et al. (2008). Pharmacol. Therap.

8 Verkningsmekanismer Neutraliserar löslig TNF inflammationsdämpande Binder membranbundet TNF Blockering / reverse signaling apoptosinduktion Interaktion med Fc receptorer ADCC Immunreglering Relevanta skillnader föreligger mellan preparaten med avseende på aviditet, farmakodynamik och -kinetik

9 Farmakokinetik Tracey, D. et al. (2008). Pharmacol. Therap.

10 Total vs fritt läkemedel mab + L [mab*l]

11 Serumnivåer av TNF vid behandling med infliximab

12 Koncentrationsbestämning av Infliximab Αnti-human IgG Detektions antikropp ALP-anti-human IgFc Infliximab Patientserum TNFα Koncentrationen av fritt TNF-bindande läkemedel korrelerar med behandlingsresultaten

13 Dalvärden av Infliximab underhållsbehandlade IBD-patienter

14 Immunogenicitet mot anti-tnf läkemedel Frekvens antikroppsbildare varierar kraftigt mellan olika studier för infliximab 10-60%! I de flesta har punktprevalensen immuniserade patienter angivits Infliximab > Adalimumab >> Etanercept

15 Faktorer som påverkar immunogeniciteten av proteinläkemedel Läkemedlet Kroppseget / främmande Substitutionsbehandling? Framställningsmetod Beredning Hantering Patienten Grundsjukdom Annan medicinering? Immunstatus T-cellsepitoper Administrationssätt (i.v. / s.c.) HLA-presentation Doseringsschema

16 Förvirrande terminologi ATI Antibodies To Infliximab AAA Antibodies Against Adalimumab HACA Human Anti-Chimeric Antibodies ADA Anti-Drug Antibodies

17 Immunogenicitet mot terapeutiska antikroppar Antikroppar mot murina sekvenser Antikroppar mot glykosylerade epitoper Allotyp-specifika antikroppar Anti-idiotypa antikroppar Neutraliserande eller icke-neutraliserande (nada vs bada)

18 Att detektera antikroppsbildning mot terapeutiska antikroppar De flesta terapeutiska antikroppar är humana IgGantikroppar med lätta kedjor av kappa (κ) typ. Kliniskt relevanta antikroppar mot läkemedel av denna typ är också humana IgG-ak Analysen kan störas av: 1. Läkemedel använd som antigen i mätmetoden 2. Läkemedel som är kvar i cirkulationen

19 Total vs fritt läkemedel igen mab + L [mab*l] mab + ADA [mab*ada]

20 Hur man kan skilja antigen från antikropp när båda är humant IgG ELISA Anti-λ light chain antikropp som sekundärreagens Konvertera läkemedlet till F(ab) 2 fragment Enzym-märkt läkemedel som sekundärreagens (bridging-elisa) Radioimmunoassay (RIA) Läkemedel som F(ab) 2 använd som sekundärreagens (Antigen Binding Assay, ABA)

21 Bridging ELISA den vanligaste metoden för ADA mot terapeutiska antikroppsläkemedel ALP-Infliximab Y Y Y Y Y Infliximab Patientserum med anti-infliximab ak

22 Felkällor vid ADA-analys med Bridging ELISA ALP-Infliximab Y Y Y Y Y Y Patientserum med anti-infliximab ak Falskt negativ: Läkemedlet blockerar (bilden) Falskt positiv: Reumatoid Faktor (RF) som korsbinder inflixmab i frånvaro av ADA

23 Bestämning av anti-infliximab antikroppar vid Karolinska universitetslaboratoriet Inhibitions-ELISA TNFα ALP-Infliximab

24 Bestämning av anti-infliximab antikroppar vid Karolinska universitetslaboratoriet Inhibitions-ELISA ALP-Infliximab TNFα Patientserum med anti-infliximab ak

25 Felkällor för inhibitions ELISA Bindning av ALP-Infliximab blockeras av LM som finns kvar i patientens blod. ALP-Infliximab Patientserum med anti-infliximab ak Y Y Y TNFα Ger falskt positivt resultat RF interfererar inte med analysen

26 Cell-baserade metoder för ADA (Bioassays) Definitionen av neutraliserande ADA (nada) = antikroppar som blockerar effekten av läkemedlet i ett cellulärt system (farmakodynamisk påverkan) Cellulära assays är obligata för läkemedelsindustrin vid validering och godkännande av nya biologiska preparat Dyrare och mer arbetsintensiva än ELISA och RIA-metoder, som påvisar bindande ADA (bada) både neutraliserande och icke-neutraliserande. Kräver vana att hantera cellinjer

27 Cell-baserade metoder för ADA Aktivering av NFkB TNF-R1 ADA Infliximab Cellulär read-out för anti-tnfläkemedel = bortfall av TNFmedierad effekt, t ex minskad TNFinducerad apoptos ilite : cellinje som uttrycker Luciferase vid TNF-signalering Kvarvarande läkemedel interfererar även här DNA NFkB response element Luciferas Tillsats av substrat och detektion av luminiscens

28 Cell-baserade metoder för klinisk rutindiagnostik? Kan tillföra information, förutsatt att vald read-out är biologiskt och kliniskt relevant. En cell-baserad assay täcker sällan alla potentiella verkningsmekanismer för ett läkemedel Icke-neutraliserande ADA kan i vissa fall också påverka behandlingsresultatet genom att förändra farmakokinetiken (ökad clearance). Beror på läkemedlet och dess farmakokinetik och -dynamik.

29 Jämförande studie av patienter med RA Läkemedelsnivåer (anti-tnf) med ELISA och ilite Binding ADA (bada) med ELISA Neutraliserade ADA (nada) med ilite

30 Läkemedelskoncentration med ELISA vs ilite infliximab n=62 adalimumab n=22 ELISA ilite ilite ELISA low > 0.4 µg/ml low > 0.4 µg/ml low low > 0.2 µg/ml > 0.2 µg/ml Bra överensstämmelse!

31 Läkemedelsnivå och ADA med ELISA infliximab adalimumab ELISA ADA ELISA ADA ADA+ ADA- ADA+ ADAdrug level drug level low low > 0.2 µg/ml > 0.2 µg/ml I sex (6) prover uppmättes låga läkemedelsnivåer men inga ADA. Ökad clearance av annan orsak än immunogenicitet.

32 Jämförelse av bada med ELISA vs nada med ilite infliximab n=46 adalimumab n=22 ELISA ilite ilite ELISA nada+ nada- nada+ nadabada bada bada bada prover är bada+ men nada- bada-negativa prover är även negativa för nada!

33 Läkemedelsnivåer, bada och nada ELISA Bioassay (ilite) ELISA (BAb)+ / ilite (NAb) + <0.2 µg/ml <0.65 µg/ml ELISA (BAb)+ / ilite (NAb) - <0.2 µg/ml <0.65 µg/ml ELISA (BAb) - / ilite (NAb) µg/ml µg/ml Tidsfråga: bada på väg att bli nada? Spelar det någon roll?

34 Drug tolerant assays Påvisar ADA som är bundet till läkemedlet Dissociera immunkomplex t ex med lååång inkubationstid eller syrabehandling och sedan förhindra reassociation innan analys av ADA Komplexa metoder Relevanta för kliniskt bruk?

35 Immunkomplex kan påvisas tidigare än fria ADA van Schouwenburg Ann Rheum Dis 2013;72:

36 Temporal evolution of ADA De flesta studier av ADA rapporterar punkt-prevalens Ungar et al analyserade s-infliximab och ADA med en drug tolerant assay i >1000 sera från 125 patienter under De flesta patienter som utvecklade persisterande ADA gjorde det under behandlingens första 12 mån. ADA-positivitet föregick klinisk loss-of-respons 26% av patienterna vid uppvisade övergående ADA-positivitet i isolerade prov, vilket inte verkade påverka behandlingseffekten Mindre än hälften av patienterna var ADA-negativa efter 4 år, trots kontinuerlig behandling Ungar et al. Gut 2014;63:

37 Monitorering av biologiska läkemedel i praktiken Börja med läkemedelskoncentrationen (dalvärde) Vid omätbara nivåer av läkemedlet komplettera med analys av ADA (om det inte utförts med automatik) Stämmer analysresultatet med den kliniska bilden? Persisterande vs temporära ADA? => Upprepad provtagning Utvärdera behandlingsjustering med intensifierad monitorering

38 Aktuellt analysutbud för biologiska läkemedel vid Karolinska universitetslaboratoriet (Klinisk immunologi, Solna) Läkemedel Koncentration ADA Infliximab (inklusive biosimilarer) JA Adalimumab JA JA Rituximab JA NEJ Vedolizumab JA NEJ (inte än iallafall) Ustekinumab JA NEJ (inte än iallafall) Etanercept Under utveckling - Goliumumab Some day maybe - JA

39 Tack till: Klinisk immunologi, Solna: Ulf Sundin Theresa Neimert-Andersson Ann-Charlotte Wikström Lena A. Nilsson Kerstin Lavenius, mfl Gastrocentrum, Karolinska: Michael Eberhardson CMM, Karolinska institutet: Anna Fogdell-Hahn Reumatologkliniken, Karolinska: Saedis Saevarsdottir

40 Frågor o/e synpunkter?