Analyser för biologiska läkemedel

Transkript

1 Analyser för biologiska läkemedel Per Marits Klinisk immunologi Karolinska universitetslaboratoriet

2 Biologiska läkemedel Biological medicinal product, biologicals Framställda genom biologiska processer; inte kemiskt syntetiserade Några huvudgrupper: 1) Rekombinant framställda kopior av kroppsegna proteiner, t ex insulin, tillväxthormon, interleukin-2 2) Monoklonala antikroppar 3) Lösliga receptorer; fusionsproteiner 4) Vacciner 5) Genterapi

3 Immunogenicitet Biologiskt Läkemedel TH B B HLA II Cytokiner CD40- CD40L Antigen-presentation för CD4+ T hjälparceller Y Y Antikroppar mot läkemedlet

4 Potentiella konsekvenser för patienten Utebliven behandlingseffekt Infusionsreaktioner Autoimmunitet

5 Vad vill vi mäta? Vad kan vi mäta? Vad bör vi mäta?

6 Drug target Läkemedelskoncentration Antikroppsbildning mot läkemedlet

7 Anti-TNF läkemedel Tracey, D. et al. (2008). Pharmacol. Therap.

8 TNF biologi Tracey, D. et al. (2008). Pharmacol. Therap.

9 Verkningsmekanismer Neutraliserar löslig TNF Inflammationsdämpande Binder membranbundet TNF Blockering / reverse signaling apoptosinduktion Interagerar med Fc receptorer ADCC Immunreglering Relevanta skillnader föreligger mellan preparaten med avseende på aviditet, farmakodynamik och -kinetik

10 Farmakokinetik Tracey, D. et al. (2008). Pharmacol. Therap.

11 Serumnivåer av TNF vid behandling med infliximab Charles et al. J Immunol 1999; 163:

12 Total vs fritt läkemedel mab + L [mab*l]

13 Koncentrationsbestämning av Infliximab Αnti-human IgG Detektions antikropp ALP-anti-human IgFc Infliximab Patientserum TNFα Koncentrationen av fritt TNF-bindande läkemedel korrelerar med behandlingsresultaten

14 Dalvärden av Infliximab hos underhållsbehandlade IBD-patienter

15 Immunogenicitet mot anti-tnf läkemedel Frekvens antikroppsbildare varierar kraftigt mellan olika studier för infliximab 10-60%! I de flesta har punktprevalensen immuniserade patienter angivits Infliximab > Adalimumab >> Etanercept

16 Faktorer som påverkar immunogeniciteten av proteinläkemedel Läkemedlet Kroppseget / främmande Substitutionsbehandling? Framställningsmetod Beredning Hantering Patienten Grundsjukdom Annan medicinering? Immunstatus T-cellsepitoper Administrationssätt (i.v. / s.c.) HLA-presentation Doseringsschema

17 Immunogenicitet mot terapeutiska antikroppar Antikroppar mot murina sekvenser Antikroppar mot glykosylerade epitoper Allotyp-specifika antikroppar Anti-idiotypa antikroppar

18 Lite terminologi ATI Antibodies To Infliximab AAA Antibodies Against Adalimumab HACA Human Anti-Chimeric Antibodies ADA Anti-Drug Antibodies

19 Att detektera antikroppsbildning mot terapeutiska antikroppar De flesta terapeutiska antikroppar är humana IgGantikroppar med lätta kedjor av kappa (κ) typ. Kliniskt relevanta antikroppar mot läkemedel av denna typ är också humana IgG-ak Analysen kan störas av: 1. Läkemedel använd som antigen i mätmetoden 2. Läkemedel som är kvar i cirkulationen

20 Totalt vs fritt läkemedel igen mab + L [mab*l] mab + ADA [mab*ada]

21 Hur man kan skilja antigen från antikropp när båda är humant IgG? ELISA Anti-λ light chain antikropp som sekundärreagens Konvertera läkemedlet till F(ab) 2 fragment Enzym-märkt läkemedel som sekundärreagens Radioimmunoassay (RIA) Läkemedel som F(ab) 2 används som sekundärreagens

22 Bridging ELISA den vanligaste metoden för ADA mot terapeutiska antikroppsläkemedel Y Y Y Y Y Infliximab ALP-Infliximab Patientserum med anti- Infliximab ak

23 Felkällor vid ADA-analys med Bridging ELISA ALP-Infliximab Y Y Y Y Y Patientserum med anti-infliximab ak Falskt negativ: Drogen blockar (bilden) Detekterar inte monovalenta IgG4-antikroppar Falskt positiv: Reumatoid Faktor (RF) som korsbinder inflixmab i frånvaro av ADA

24 Bestämning av anti-infliximab antikroppar vid Karolinska universitetslaboratoriet Inhibitions-ELISA TNFα ALP- Infliximab

25 Bestämning av anti-infliximab antikroppar vid Karolinska universitetslaboratoriet Inhibitions-ELISA ALP-Infliximab TNFα Patientserum med anti-infliximab ak

26 Felkällor för inhibitions ELISA Bindning av ALP-Infliximab blockeras av LM som finns kvar i patientens blod. ALP-Infliximab Y Y Y TNFα Patientserum med anti- Infliximab ak Falskt positivt resultat RF interfererar inte med analysen

27 RIA ADA I 125 IFX-F(ab ) 2 Protein A Potentiella fördelar: Märkt läkemedlet i löslig fas in vivo Troligen mindre känslig för kvarvarande läkemedel Nackdel: Radioaktivitet

28 Cell-baserade metoder för ADA Definitionen av neutraliserande ADA = antikroppar som blockerar effekten av läkemedlet i ett cellulärt system (farmakodynamisk påverkan) Cellulära metoder krävs av läkemedelsindustrin vid validering och godkännande av nya biologiska preparat Dyrare och mer arbetsintensiva än ELISA och RIA-metoder Kräver vana att hantera cellinjer

29 Cell-baserade metoder för ADA Aktivering av NFkB DNA TNF-R1 NFkB response element ADA Infliximab Luciferas Cellulär read-out för anti-tnfläkemedel = bortfall av TNFmedierad effekt, t ex minskad TNF-inducerad apoptos ilite : cellinje som uttrycker Luciferase vid TNF-signalering Kvarvarande läkemedel interfererar med detektion av ADA Tillsats av substrat och detektion av luminiscens

30 Cell-baserade metoder för klinisk rutindiagnostik? Kan ev. tillföra information, förutsatt att vald read-out är biologiskt och kliniskt relevant En cell-baserad assay täcker sällan alla potentiella verkningsmekanismer för ett läkemedel Bindande (icke-neutraliserande) ADA kan också påverka behandlingsresultatet genom att förändra farmakokinetiken (ökad clearance)

31 Är olika metoder jämförbara? Metoder för koncentrationsbestämning av anti-tnfs uppvisar generellt god linjär korrelation Vid en publicerad blindad jämförelse av assays för ATI var RIA (Sanquin) marginellt känsligare än bridging-elisa (Leuwen) men överensstämde kvalitativt väl (Vande Casteele, Aliment Pharmacol Ther 2012). ELISA-metoderna för LM-konc och ADA som används på Karolinska är validerade mot analyserna i Sanquin och Leuwen Jämförelse med en cell-baserad metod pågår

32 Drug tolerant assays

33 Drug tolerant assays Påvisa ADA som är bundet till läkemedlet Dissociera immunkomplex t ex med lååång inkubationstid eller syrabehandling och sedan förhindra reassociation innan detektion av ADA Kan potentiellt hitta ADA tidigare och möjliggöra åtgärder för att förebygga terapisvikt Komplexa metoder Relevanta för kliniskt bruk?

34 Drug tolerant assays Bloem et al (2014) jämförde vanlig RIA för antiadalimumab ak med fyra läkemedels-toleranta versioner i en kohort av RA-patienter Den vanliga RIA:n hittade ADA hos 14 av 94 pat (15%) jfr med pat (51-57%) med de toleranta analyserna Prover som innehöll högre nivåer av ADA med de drogtoleranta metoderna uppvisade lägre adalimumab-nivåer Inga kliniska data för patienterna

35 Temporal evolution of ADA De flesta studier av ADA rapporterar punkt-prevalens Ungar et al analyserade s-infliximab och ADA med en drug tolerant assay i >1000 sera från 125 patienter under De flesta patienter som utvecklade persisterande ADA gjorde det under behandlingens första 12 mån. ADA-positivitet föregick klinisk loss-of-respons 26% av patienterna vid uppvisade övergående ADA-positivitet i isolerade prov, vilket inte verkade påverka behandlingseffekten Mindre än hälften av patienterna var ADA-negativa efter 4 års, trots kontinuerlig behandling Ungar et al. Gut 2014;63:

36 Praktisk monitorering av biologiska LM Börja med läkemedelskoncentrationen (dalvärden) Vid omätbara nivåer av läkemedlet komplettera med analys av ADA (om det inte utförts per automatik) Persisterande vs temporära ADA? Upprepad provtagning vid osäkerhet Utvärdera behandlingsjustering med intensifierad monitorering Ring gärna lab för diskussion!

37 Aktuellt analysutbud för biologiska läkemedel vid Karolinska universitetslaboratoriet (Klinisk immunologi, Solna) Läkemedel Koncentration ADA Infliximab (inklusive biosimilarer) JA JA Adalimumab JA JA Rituximab JA NEJ Etanercept Under utveckling - Goliumumab Under utveckling - Vedolizumab Under utveckling - Ustekinumab Under utveckling -

38 Tack till: Klinisk immunologi, Solna Ulf Sundin Ann-Charlotte Wikström Lena A. Nilsson Kerstin Lavenius Ann-Britt Johansson Gastrocentrum, Medicin Michael Eberhardson

39 Frågor o/e synpunkter?