Droplet Digital PCR Ny metod för identifiering och kvantifiering av HTLV

Storlek: px

Starta visningen från sidan:

Download "Droplet Digital PCR Ny metod för identifiering och kvantifiering av HTLV"

Lisbeth Fransson
för 8 år sedan
Visningar:

Droplet Digital PCR Ny metod för identifiering och kvantifiering av HTLV Sara Thulin Hedberg, Molekylärbiolog, PhD Lorraine Eriksson, Kerstin Malm, Maria A Demontis*, Paula Mölling, Martin Sundqvist,

1 Droplet Digital PCR Ny metod för identifiering och kvantifiering av HTLV Sara Thulin Hedberg, Molekylärbiolog, PhD Lorraine Eriksson, Kerstin Malm, Maria A Demontis*, Paula Mölling, Martin Sundqvist, Graham P Taylor*, Sören Andersson & Sara Thulin Hedberg Laboratoriemedicinska Länskliniken, Molekylärdiagnostik F&U /Klinisk Mikrobiologi Universitetssjukhuset Örebro *National Centre for Human Retrovirology, St Mary s Hospital, London, England.

Sören Andersson & Sara Thulin Hedberg Laboratoriemedicinska Länskliniken, Molekylärdiagnostik F&U /Klinisk

2 Humant T lymphotroft virus (HTLV) Humana retrovirus, 2 typer; typ 1 och 2 HTLV-virus överförs genom smittade blodprodukter, orena kanyler, sexuell kontakt och från mor till barn. Individer som smittas tidigt i livet är de som har störst risk att utveckla symtom. Ofta asymptomatiskt HTLV-1 är associerat med adult T-cells leukemi/lymfom (5 %), HTLV-1 associerad myelopati/tropisk spastisk pares (2-3 %) och uveit samt opportunistiska infektioner Låg prevalens i Sverige 0,003 % bland blodgivare, men 3,2 % bland intravenösa missbrukare i Stockholm. Prevalensen av HTLV är högst i södra Japan, intertropiska Afrika, Melanesien, Latin-amerika och Karibien.

Ofta asymptomatiskt HTLV-1 är associerat med adult T-cells leukemi/lymfom (5 %), HTLV-1 associerad myelopati/tropisk spastisk pares (2-3 %) och uveit samt

3 HTLV-diagnostik i Sverige Det är obligatoriskt att screena alla blod- och plasmagivare i Sverige för HTLV. Dessutom testas par som utreds för assisterad befruktning och fall där klinisk misstanke om HTLV-infektion finns. Infektionen omfattas av smittskyddslagen. Diagnostiken av HTLV-1 och HTLV-2 görs i första hand genom påvisande av specifika antikroppar mot virus. Konfirmation med ytterligare antikroppstest eller vid behov PCR. Efter diagnos följs patienterna upp med en s.k. pro-viral load (PVL) test (PCR), för att påvisa och kvantifiera virusmängden (DNA) i blodet. PVL = Antal DNA-kopior av HTLV per PBMC Uttrycks som % infekterade celler Högt PVL = Högre risk att utveckla HTLV-relaterade sjukdomar

Diagnostiken av HTLV-1 och HTLV-2 görs i första hand genom påvisande av specifika antikroppar mot virus. Konfirmation med ytterligare antikroppstest eller vid behov PCR.

4 HTLV-diagnostik i Sverige Laboratoriemedicinska Länskliniken, USÖ är referenslab för HTLV på uppdrag av Folkhälsomyndigheten, vilket innebär att prover från hela landet skickas till vårt laboratorium. Ingen PCR-metod för bedömning av pro-viral load har fram till nu funnits i Sverige och saknas även i merparten av europeiska länder. Proverna har skickats till London (Imperial College, St Mary s Hospital) för bedömning av pro-viral load.

Ingen PCR-metod för bedömning av pro-viral load har fram till nu funnits i Sverige och saknas även i

5 Syfte Att utveckla och utvärdera en ddpcrbaserad assay för identifiering, kvantifiering och bestämning av PVL för HTLV-1 och HTLV-2

6 Droplet Digital PCR (ddpcr) ddpcr är en nukleinsyradetektionsmetod som möjliggör absolut kvantifiering av DNA- och RNA-molekyler utan att behöva använda standardkurvor.

7 Material Material & Metod 60 HTLV-1 pos (PVL 0,01 % - 59,8 %) 12 HTLV-2 pos (PVL 0,02 % - 11,3 % ) 20 negativa prover (friska blodgivare) Spädningsserier i buffy-coat av HTLV-1 resp. HTLV-2 Kliniska prover körs både ospädda (2 brunnar) och spädda 1/10 (1 brunn)

blodgivare) Spädningsserier i buffy-coat av HTLV-1 resp.

9 Resultat Temperaturgradient Vald annealingtemperatur 60 C

10 0.9 primer 0.4 probe 1.2 primer 0.4 probe Resultat Primer, Probe konc. 1,2 µm primer HTLV-1/RPP30 0,9 µm primer HTLV-2/RPP30 0,25 µm probe 0.9 primer 0.1 probe 1.2 primer 0.1 probe 0.9 primer 0.25 probe 1.2 primer 0.25 probe

11 Resultat A B 0,69 % C D 9,97 % 57,5 % Exempel på en 2D ddpcr plot från patienter med olika PVL. Plot A är en frisk blodgivare inte infekterad med HTLV. Plot B-D är patienter med ökande PVL, 0,69 %, 9,97 % och 57,50 %.

12 Intra-assay variabilitet HTLV-1: CV = 0,97-3,34 % HTLV-2 CV = 1,71-8,2 % Inter-assay variabilitet HTLV-1: CV = 1,84-6,13 % HTLV-2 CV = 1,18-12,89 % Resultat PROBIT HTLV c/ml 100 % 444 c/ml 40 % HTLV c/ml 100 % 444 c/ml 20 %

1,84-6,13 % HTLV-2 CV = 1,18-12,89 % Resultat PROBIT HTLV-1

13 ddpcr PVL Resultat 10 Korrelation mellan qpcr och ddpcr 8 6 r = qpcr PVL

14 Inno-LIA qpcr ddpcr Totalt antal prover Positiv Negativ Positiv Negativ HTLV-1 positiv Resultat qpcr vs ddpcr Kliniska prover HTLV-2 positiv Indeterminant Negativ

qpcr vs ddpcr Kliniska prover 53 5 56 2 58 HTLV-2

15 Resultat Falsk positivitet och svagt positiva prover 3 droppar kunde i vissa fall detekteras i NTC under optimering och utvärdering av ddpcr-metoden. Prover bedömdes som positiva om >3 droppar i en brunn. Svagt positiva prover (1-3 droppar) sätts om i en simplex reaktion, med bara HTLV-1 eller HTLV-2 primers och probe, i 4 brunnar. Duplex Simplex

Prover bedömdes som positiva om >3 droppar i en brunn.

16 Effekter av punktmutationer i probesitet i HTLV-1 Mutation C A alt. C T Ingen mutation

17 Konklusioner ddpcr möjliggör pålitlig och känslig bestämning av PVL för både HTLV-1 och HTLV-2. Korrelationen mellan PVL analyserade med qpcr och PVL analyserade medd ddpcr är mycket bra. Den låga intra- och inter-assay variabiliteten gör ddpcr till en lämplig metod för HTLV-diagnostik och för att följa patienter över tid. Sedan 1 juni kvantifieras och bestäms HTLV PVL med ddpcr på Laboratoriemedicinska Länskliniken, Molekylärdiagnostik FoU.

Den låga intra- och inter-assay variabiliteten gör ddpcr till en lämplig metod för HTLV-diagnostik och för att

18 Tack!

Relevanta dokument

Sören Andersson. Professor, prefekt, överläkare. Institutionen för medicinska vetenskaper Örebro universitet & Laboratoriemedicin, Region Örebro län

Sören Andersson. Professor, prefekt, överläkare. Institutionen för medicinska vetenskaper Örebro universitet & Laboratoriemedicin, Region Örebro län Konfirmation av HIV och HTLV Sören Andersson Professor, prefekt, överläkare Institutionen för medicinska vetenskaper Örebro universitet & Laboratoriemedicin, Region Örebro län Diagnostiska principer HIV