Utvärdering av BD MAX enteric parasite panel på ett kliniskt laboratorie

Transkript

1 Utvärdering av BD MAX enteric parasite panel på ett kliniskt laboratorie Georgina Isak a, Leigh Davidsson a, Stina Boräng b, Silvia Botero-Kleiven b a Enhet för parasitologi och vattenburen smitta, Folkhälsomyndigheten b Klinisk Mikrobiologi, Karolinska Universitetssjukhuset, Huddinge

2 BDMAX enteric parasite panel Allt-i-ett automatiserat system DNA-extraktion och multiplex realtids-pcr Fecesprov, 10 µl färskt eller 10 % formalin-fixerat Resultat inom ca 4 h Detekterar: Cryptosporidium parvum och C. hominis Giardia intestinalis Entamoeba histolytica Sid 2.

3 Tre smittsamma sjukdomar Giardia intestinalis, Entamoeba histolytica och Cryptosporidium spp Anmälningspliktiga och smittspårningspliktiga De kan smittas från människa till människa i Sverige Smittsamma sjukdomar är anmälningspliktiga enligt smittskyddslagen (2004:168) och smittskyddsförordningen (2004:255). Syftet med smittskyddslagen är att begränsa förekomsten av smittsamma sjukdomar inom landet. Detta innebär att man skall försöka förhindra vidare spridning från personer som bär på det aktuella smittämnet och att smittade personer ska hittas för att erbjuda behandling eller på annat sätt begränsa fortsatt spridning. Sid 3.

4 Pilotstudie, september 2015 Utvärderat: Riktighet: Recovery studie Kan inte göra en jämförelsestudie - vi har ingen metod som kan använda 10 µl formalin-fixerat prov för parasitdiagnostik Panel med välkaraktäriserade prover Analytisk specificitet: Inklusivitet och exklusivitet Mellanliggande precision: Samma prov analyserades två gånger på olika dagar (samma utförare) Sid 4.

5 Cryptosporidium species Intracellulär parasit som orsakar vattniga diarréer och buksmärtor. Immunsupprimerade individer kan få kroniska symtom med livshotande diarré. C. parvum och C. hominis - vanligaste arterna som orsakar sjukdom hos människor. Ca 400 fall rapporteras årligen i Sverige, laboratoriekonfirmerad 59 % är inhemska fall Cryptosporidium oocystor Foto: Marianne Lebbad, Folkhälsomyndigheten Sid 5.

6 Giardia intestinalis Vanligaste orsaken till parasit-inducerad diarré i Skandinavien Ca 1400 fall rapporteras årligen i Sverige De flesta fall (79 %) är importerade 49 % av fall är hos barn < 15 år Giardia cystor och trofozoiter Foto: Folkhälsomyndigheten Sid 6.

7 Entamoeba histolytica Orsakar invasiv amoebiasis: intestinal och extraintestinal (främst i levern). Ca 130 fall rapporteras årligen i Sverige, troligen lägre Vissa mikroskopi-positiva fall rapporteras som E. histolytica utan verifiering av species Cystor av E. histolytica och den apotogen E. dispar kan inte skiljas med mikroskopi E. histolytica/e. dispar-cysta i feces, trichromfärgning. Foto: Marianne Lebbad, Folkhälsomyndigheten Sid 7.

8 Utvärderingspanel Blind panel med 32 patientprov med 11 olika parasiter Alla prov var välkaraktäriserade innan testning 31 % patientprov innehöll >1 parasit-art Kliniska prov från patienter, inga spikade prov Patientprov samlades under en kort period Inga frysta prov som kunde påverka DNA-extraktion Mellan 3-19 månader gamla, genomsnit 10 månader Alla prover anonymiserades genom att använda en unik kod Sid 8.

9 Panelen 11 olika parasiter och 2 prov utan parasiter Parasit Antal prov Cryptosporidium species* 12 Giardia intestinalis 11 Entamoeba histolytica* 4 Dientamoeba fragilis 2 Entamoeba polecki* 3 *Verifierad med PCR och resten med mikroskopi Endolimax nana 4 Blastocystis spp 4 Entamoeba coli 4 Entamoeba dispar* 1 Hymenolepis nana 2 Enterobius vermicularis 1 Negativ 2 Sid 12.

10 Cryptosporidium species Riktighet och analytisk specificitet Antal prov analyserad med BD MAX Körning 1 Körning 2 Båda körningar Cryptosporidium spp positiv 11/12 9/12* 20/24 Cryptosporidium spp negativ 20/20 20/20 40/40 3 av 5 (60 %) prov med få parasiter enligt mikroskopi blev falskt negativa i en körning Ett positivt prov* blev inhiberat i en körning Vi har visat att BDMAX kan också detektera C. meleagridis Sid 13.

11 Cryptosporidium species Mellanliggande precision Cq-värden Mikroskopi Prov Körning 1 Körning 2 Cq-skillnad resultat 1 39,5 34,9 4,6 Måttligt 2 29,4 31,4 2 Många 3 29,6 35,9 6,3 Många 4 31,6 33,8 2,2 Få 5 33,7 32,9 0,8 Få ,1 Få 7 39,2 0 Få 8 36,2 UNR Måttligt ,9 1,1 Måttligt 10 33,1 32,9 0,2 Många 11 34,6 0 Få 12 31,9 31,2 0,7 Måttligt Stora variationer i Cq-värden mellan körningar, även i prov med måttligt/många parasiter 25 % av prov blev falska negativa med en körning Sid 14.

12 Giardia intestinalis Riktighet och analytisk specificitet Antal prov analyserad med BD MAX Körning 1 Körning 2 Båda körningar G. intestinalis positiv 11/11 11/11 22/22 G. intestinalis negativ 21/21 21/21 42/ % riktighet och 100 % analytisk specificitet Sid 15.

13 Giardia intestinalis Mellanliggande precision Cq-värden Prov Körning 1 Körning 2 Cq-skillnad 1 32,5 31,7 0,8 2 23,2 23,3 0,1 3 29,1 28 1,1 4 23,4 24,5 1,1 5 30,1 29, ,9 0,9 7 26,2 26,5 0,3 8 23,4 23,8 0,4 9 29,6 30,2 0, ,3 20,9 0, ,8 21 1,2 Hög mellanliggande precision Största skillnaden i Cq 1,2 Sid 16.

14 Entamoeba histolytica Riktighet och analytisk specificitet Antal prov analyserad med BD MAX Körning 1 Körning 2 Båda körningar E. histolytica positiv 3/4* 4/4 7/8 E. histolytica negativ 28/28 28/28 56/56 Ett prov* var falskt negativt för E. histolytica Feces-provet var formalin-fixerat, negativt med mikroskopi och positivt med vår realtids-pcr Sid 17.

15 Entamoeba histolytica Mellanliggande precision Prov Cq-värden Körning 1 Körning ,2 Cq-skillnad 2 22,6 22,4 0,2 3 29,7 30,9 1,2 4 31,1 32,1 1 Ett prov med få parasiter var negativ i en körning Vårt PCR-resultat Cq = 24 Hög mellanliggande precision för de andra prov med lägre Cq-värden Sid 18.

16 Slutsats Inga falska positiva resultat för alla tre målparasiter Bra resultat för Giardia intestinalis C. meleagridis kan också detekteras med BDMAX enteric parasite panel Värd att testa om BDMAX kan detektera andra Crytosporidium-arter Leverabscess kan också analyseras Etanol-fixerade prov kan användas Inhibition i 3 % av prov, omkörning behövs Risk att missa positiva prov om analysen bara görs en gång, särskilt prov med få parasiter Falska negativa resultat i 6 % av prov Sid 20.

17 Åtgärden att minska risken Antal parasiter i 10 µl volym kan variera från ett försök till ett annat Två extra steg innan BDMAX-analys kan förbättra resultat: Steg 1: Parasiter fördelas jämt genom homogenisering Steg 2: Mekanisk sönderdelning av cyst- eller oocystväggen Frigör nukleinsyror Får bort inhibitorer samt stora partiklar i feces (centrifugeringssteg) Sid 21.

18 Tack Annika Hellberg som testade alla prov med BDMAX Folkhälsomyndigheten som köpte BDMAX kits Sid 22.

19 Tankar innan implementering Vilken strategi har vi för detektion av parasiter i feces? Screena alla fecesprov med PCR? Testa bara prov med frågeställning diarré? Testa bara prov med frågeställning Crytosporidium/Giardia/E. histolytica? Vad är risken om man inte gör mikroskopi längre? Hur bedömer vi vilken PCR-metod är bäst? Hur utvärderar och validerar vi metoderna? Vilka prov/paneler använder vi? Sid 23.