Ny faecesdiagnostik med PCR

Transkript

1 Ny faecesdiagnostik med PCR Arne Kötz Klinisk mikrobiologi och vårdhygien Region Halland

2 Prover Halland 2010 Allmän bakterieodling Odling-Pinnprov prover/år Parasit Mikroskopi-Behandlad faeces prover/år Calicivirus PCR-Faeces prover/år Clostridium difficile Antigen-Faeces prover/år Rota/Adenovirus Antigen-Faeces 200 prover/år

3 Mål Enhetlig diagnostik: skapa ett gemensamt flöde för alla prover med diarréfrågeställning (Bakterier, parasiter och virus). ge möjlighet att kombinera analyser utifrån klinisk bild samt att gå vidare med samma prov om primär frågeställning blir negativ. Bakterier Virus Parasiter

4 Metodval - PCR Finns metoder för alla smittämnen Bra sensitivitet/specificitet Automatisering Rimlig kostnad Kort analystid

5 FaecesPCR 2011/ faecesprover med Baktfrågeställning per månad under ett år PCR-metoder mot 16 olika smittämnen; bakterier, virus och parasiter Upparbeta samtliga prover med gemensamt protokoll

6 Påvisade mikroorganismer Bakterier Virus Parasiter EAEC Norovirus G1 Cryptosporidium parvum/homini ETEC Norovirus G2 Dientamöba fragilis EHEC Sapovirus Giardia intestinalis Shigella/EIEC Rotavirus Salmonella enterica/bongori Astrovirus Campylobacter jejuni/coli Yersinia enterocolitica Clostridium difficile 16 targets + IAK och prover -> datapunkter

7 Andel positiva analyser 548 av 1136 positiva för minst ett smittämne (48 %) 23 % av positiva prover multipelpositiva 1.1 % inhibition primärt, 0.3 % inhib efter spädning 12,0% 10,0% 8,0% 6,0% 4,0% 2,0% 0,0%

8 Smittämnen utland 323 utland 153 ej utland 660 ingen information Utlandsassocierade 30% 25% 20% 15% EAEC CAMP ETEC SALM GIA SHIG 10% 5% Ej utlands-associerade 0% Utland Ej utland och "vet ej" DIE NOR2 CDF SAP ROT

9 Diarrédiagnostik Hälsokontroll Campylobacter, Salmonella, Shigella/EIEC, EHEC, Yersinia, Inhemsk smitta Hälsokontroll plus Dientamöba, Cryptosporidium, Giardia. Utlandssmitta Inhemsk smitta plus EAEC, ETEC och Entamöba histolytica Salm Crypto EHEC E. hist Camp Dient Yersinia EAEC IAK Giardia Shig/EIEC ETEC

10 Virus och Clostridium Upparbetas med samma protokoll men separata beställningar på remiss Annan epidemiologi: Virus vårdrelaterad spridning Clostridium antibiotika-associerad

11 Sedan började diskussionerna Alldeles för mycket att hantera för kliniska kollegor? Vill man veta det här? Gör man patienterna oroliga? Merarbete för infektionsläkare? Ska man behandla den här? Klinisk relevans av vissa agens? Tveksamhet efter Dientamoeba- utbrottet i Jönköping. Bärarskap eller missat tidigare? Rätt att anmäla PCR-fynd enligt SmL?

12 Klinisk relevans av vissa agens? Tveksamhet efter Dientamoeba- utbrottet i Jönköping. Vår sammanfattning av litteraturgenomgången: if Dientamoeba is detected in a symptomatic patient in the absence of any other pathogen, Dientamoeba must be regarded as the cause of illness and the patient should undergo appropriate treatment. Barett et al. Review i Gut Microbes feb 2011

13 Andel pos Bärarskap eller missat tidigare? PCR mot odling 9,0% 8,0% 7,0% 6,0% 5,0% 4,0% 3,0% 2,0% 1,0% 0,0% CAMP SALM EHEC SHIG/EIEC YER PCR% 7,9% 3,1% 1,6% 1,3% 0,5% Odling% 6,4% 2,6% 0,6% 0,4% 0,2% Dessutom: undersökningar från olika ställen från faeces: mycket olika kvantiteter av organismer

14 Sedan började diskussionerna Alldeles för mycket att hantera för kliniska kollegor? Vill man veta det här? Gör man patienterna oroliga? Merarbete för infektionsläkare? Ska man behandla den här? Klinisk relevans av vissa agens? Tveksamhet efter Dientamoeba- utbrottet i Jönköping. Bärarskap eller missat tidigare? Rätt att anmäla PCR-fynd enligt SmL?

15 Och den gamla hederliga parasitmikroskopin ( cystor och maskägg )? behövs inte för cystor längre: de relevanta finns med i PCR-diagnostiken behövs knappt för maskägg: i genomsnitt 1 positivt fynd per år!

16 FLÖDE DAG 0: Provsättning DAG 1: Extraktion, PCR och svar DAG 2-4: Odling, serotypning, RES

17 Provupparbetning Slamma faeces i E-svab transportmedium (1 ml) Vortex 1 minut 95 C 10 minuter 100 µl till easymag Lysbuffert (BioMerieux) 10 µl Salmonella anrikningsbuljong Extraktion Generic Protocol easymag

18 QiaSymphony Klarar komplex pipettering till PCR Mindre hands on Mål tvåvägs kommunikation med LIS (arbetslista och resultatrapportering)

19 QiaSymphony protokoll Slamma Faeces i 1.2 ml Lysbuffert (BioMerieux) Vortex 15 minut -20 C över natt 50 µl Salmonella anrikningsbuljong Centrifugera 3500 rpm 10 minuter Extraktion/pipettering QiaSymphony PCR RotorGeneQ

20 PCR-styrd odling Inhemska Salmonella Shigella/EIEC EHEC Yersinia Inneliggande Campar

21 Targets Referens Target Kommentar Salmonella Malorny et al. App Env Mic :7046 ttrbca (k) Väl validerat. Täcker S. enterica och S. bongori. Shigella/EIEC Thiem et al. J Clin Mic :2031 ipah (p) Väl validerad. Täcker alla fyra arter av Shigella samt EIEC. Best. FEMS let :237. de Boer et al. J Clin Mic Campylobacter jejuni 48:4140 mapa Väl validerat av Best framför allt. Proben från de Boer. Campylobacter coli Best. FEMS let :237. ceue Väl validerat av Best. EHEC Chui et al. J Mol Diag :469 stx1 och stx2 (k) Väl validerad. Jämfört olika PCR-metoder. Yersinia enterocolitica Lambertz et al. App Env Mic :6060 ail (k) Väl validerad. Täcker Y. enterocolitica associerad med human sjukdom. EAEC Hardegen et al. Clin Mic and Antimic :5 aata på pcvd432 (p) pcvd bästa markör men inte så många studier. Påvisar "typical" EAEC. ETEC Hardegen et al. Clin Mic and Antimic :5 ST och LT (?) Väl etablerade markörer. Cryptosporidium Bruijnesteijn van Coppenraet et al. CMI : bp fragment Etablerad markör. Validerad mot TFT (triple faecal test), bättre än mikroskopi men få positiva Entamoeba histolytica Verweij et al. J Clin Mic :1220 ssu rdna Etablerad markör. OK validerad. Amplifierar histolytica och dispar, proben histolytica-specifik. Dientamoeba fragilis Verweij et al. Mol Cell Probes : s rdna Etablerad markör. Väl validerad mot TFT (triple faecal test) av Bruijnesteijn Giardia intestinalis Verweij et al. J Clin Mic :1220 ssu rdna Väl validerat av Verweij 2004 och deboer 2010.

22 PCR-reaktioner C. diff Salm Crypt EHEC Rota NorG1 Astro ETEC Camp Dient Yers EHI NorG2 Sapo EAEC IAK Giard Shig IAK

23 PCR-styrd odling Salmonella 36/36

24 PCR-styrd odling EHEC 9/15 Yersinia 3/5 Shigell/EIEC 5/19