Mikrobiologins tekniksprång Dr. Erik Nygren SP Food and Bioscience

Transkript

1 Mikrobiologins tekniksprång Dr. Erik Nygren SP Food and Bioscience

2 Mikrobiologins tekniksprång Den högteknologiska mikrobiologin erbjuder idag nya verktyg för att förebygga smittspridning och öka produktsäkerhet. Hur arbetar SP inom detta område? Dagens presentation 1. Bakgrund: Mikrobiologi och infektionssjukdomar. 2. Sekvensering. 3. Hur arbetar vi med metagenomik.

3 Mikrobiologi och infektionssjukdomar Mikroorganismer är osynliga för blotta ögat. Klassificering Fem stora grupper: bakterier, alger, svampar, protozoer och virus. Infektionssjukdomar Orsakas av patogena eller opportunistiska mikroorganismer. Kan mätas i DALY Summan av de år som förloras på grund av förtidig död och de år som förloras på grund av funktionshinder.

4 Hur kontrolerar vi infektionssjukdomar? Immunitet Barnvaccinationsprogram. Hygien Sanitetsförbättringar. Livsmedelskontroll. Förbättra personlig och professionell hygien och antiseptisk teknik. Kemoterapi Selektiv toxicitet. Resistensbekämpning.

5 Sekvensering av isolerade mikroorganismer ger beslutsunderlag Släktskap mellan isolerade mikroorganismer kartläggs med hjälp av sekvensering. Ribosomalt RNA, MLST, specifika gener eller hela genom. Förekomst av virulensgener? Ursprungsspårning kräver hög upplösning? Joffré E. et al. J. Bacteriol Evolution of H3N2, McHardy A.C, et al. 2009

6 Metagenomik ger information om samspel mellan organismer i en viss miljö Förutsättningslös identifiering av komplexa samhällen. Odlingsbara och icke odlingsbara organismer. Den sammantagna arvsmassan = mikrobiom. Isolerat DNA/RNA måste vara: Koncentrerat, icke-fragmenterat och rent (utan inhibitorer, RNA och protein) Community DNA extraction 16S PCR amplification Sequencing Bioinformatics Community identification

7 Identifiering av mikroflora: Bioinformatik - Pipeline för sekvenseringsdata 1 DNA sekvensering kvalitetskontroll Program Trim Galore, cutoff Q Subsampling av DNA sekvenser reads väljs ut slumpmässigt. Klassificering och kvantifiering Programet Metaxa2 identifierar 16S sekvenser genom specificitet Antal identifierade unika sekvenser används för kvantitativa jämförelser Taxa Prov 1 Prov 2 Prov 3 Total reads Bacteria;Firmicutes Bacteria;Proteobacteria Bacteria;Actinobacteria Bacteria;Bacteroidetes Chloroplast;Unclassified Chloroplast Unknown; Bacteria;Fusobacteria Bacteria;Unclassified Bacteria Bacteria;Deinococcus-Thermus Bacteria;Spirochaetes Bacteria;Acidobacteria Mitochondria;Unclassified Mitochondria Bacteria;Cyanobacteria Bengtsson-Palme J et. al, Mol Ecol Resour Mar 2

8 Bioinformatik: Visualisering 4 Programmet Krona ger klickbara bilder Sammansättningen i ett prov eller grupp Prov 1 Prov 2 Prov 3

9 Bioinformatik: Visualisering och samband 5 Principalkomponentanalys(PCA) Standardmetod för att beskriva och visualisera den dominerande strukturen i ett multivariat dataset. Mönster bland observationerna och hos variablerna. Komponenter som visar störst variation. Vi använder programmet R. Gruperar prov. Tex. Phylum och genus nivå. Inter-environmental comparison with a principal component analysis.

10 Tack för uppmärksamheten!

11 Pågående projekt: Förbättra personlig hygien och antiseptisk teknik. Bakgrund Händerna är en mycket stor källa till smittspridning och handtvätt är avgörande för att begränsa denna. Handtvätt behöver utföras så att patogena bakterier elimineras samtidigt som de önskvärda bakterierna inte påverkas negativt. Målsättning Anpassa 16S rrna PCR och sekvensering för att kunna utvärdera den mikrobiologiska floran på händer på ett effektivt och heltäckande sätt. Studera stabiliteten i den normala handfloran över tiden. Bestämma effekter på handfloran vid tvätt och desinfektion.

12

13 Förbättra personlig hygien och antiseptisk teknik. Handens mikroflora utvärderad genom storskalig sekvensanalys Dr. Klara Båth och Dr. Erik Nygren?! = Bakgrund Händerna är en mycket stor källa till smittspridning och handtvätt är avgörande för att begränsa denna. Handtvätt behöver utföras så att patogena bakterier elimineras samtidigt som de önskvärda bakterierna inte påverkas negativt. Målsättning Anpassa 16S rrna PCR och sekvensering för att kunna utvärdera den mikrobiologiska floran på händer på ett effektivt och heltäckande sätt. Studera stabiliteten i den normala handfloran över tiden. Bestämma effekter på handfloran vid tvätt och desinfektion. Förväntade resultat PCR och high-throughput sequencing anpassas för att kunna följa hur samansättningen av mikroorganismer på händer påverkas. Community DNA extraction 16S PCR amplification Sequencing Bioinformatics Mapping assembly Community identification

14 Identifiering av mikroflora: Bakgrund? Kartläggning av samhällen bestående av bakterier och/eller svampar (jäst och mögel)! = Förutsättningslös identifiering av komplexa samhällen - icke odlingsbara och odlingsbara Utmanande provtagning och DNA preparation Sekvensering av 16S (eller ITS) Stora mängder data och metadata skapas kräver avancerad bioinformatik dagens flaskhals Metadata skapar etiska dilemman

15 Identifiering av mikroflora: Provtagning vid handtvättstudie?! Provtagningen måste anpassas till DNA/RNAprepparationens begränsning Ytterst viktigt att metoden fungerar optimalt Upprepad provtagning kan komma att krävas. Tex. tisdag, fredag, måndag - start Block 1: försökspersoner delas i två grupper Vecka 1: Initiering Provtagning görs med hand i påse teknik. 50 ml buffer solution (0.07 M PBS, 0.1% Tween-80). x ml prov vätska centrifugeras ner. Pelleten fryses -20 grader C. = För att undvika eventuella årstidsvariationer så delas försökspersonerna in i två grupper. Handtvätten utförs i två block Under 5 dagars tid får sedan Gr 1: tvätta händerna med tvål Gr 2: tvätta händerna med tvål & handsprit Vecka 1: Provtagning av effekt Provtagning görs som ovan.

16 Förbättra personlig hygien och antiseptisk teknik. Handens mikroflora utvärderad genom storskalig sekvensanalys Dr. Klara Båth och Dr. Erik Nygren?! = Bakgrund Händerna är en mycket stor källa till smittspridning och handtvätt är avgörande för att begränsa denna. Handtvätt behöver utföras så att patogena bakterier elimineras samtidigt som de önskvärda bakterierna inte påverkas negativt. Målsättning Anpassa 16S rrna PCR och sekvensering för att kunna utvärdera den mikrobiologiska floran på händer på ett effektivt och heltäckande sätt. Studera stabiliteten i den normala handfloran över tiden. Bestämma effekter på handfloran vid tvätt och desinfektion. Förväntade resultat PCR och high-throughput sequencing anpassas för att kunna följa hur samansättningen av mikroorganismer på händer påverkas. Community DNA extraction 16S PCR amplification Sequencing Bioinformatics Mapping assembly Community identification

17 Virus på vår hud 1. Patogena transienta virus så som Norovirus och Influensavirus kan detekteras 2. Replikerande virus. Vissa har förmåga att föröka sig i bakterier (bakteriofager) Andra i våra eukaryota celler (eukaryota virus) Flera eukaryota polyomavirus har identifierats i hudprover Ett har kopplats samman med utveckling av Merkel cell carcinoma Bakteriofagerna är de vanligaste virusen på vår kropp och modulerar den mikrobiella floran Medierar horisontell överföring av antibiotikaresistens, virulensfaktorer eller gener som ger metabola fördelar. Andra bakteriofager har istället förmåga att påverka spridningen, uppbyggnaden och sammansättningen av mikrobiotan.

18 Helgenomsekvensering för studier av virus som en del av handens mikrobiota. Dr. Erik Nygren? Bakgrund Kroppen koloniseras av en mikrobiota bestående av bakterier, Arkéer och svampar. Att virus också ingår har först nyligen uppmärksammats. Dessa virus och mikroorganismerna samspelar vid bibehållandet av god hälsa. Community DNA and RNA extraction Whole genome sequencing! = Målsättning Vidareutveckla och anpassa metodik för extraktion av RNA och DNA. Anpassa qpcr för kvantifiering av specifik virustyp. Utveckla metodik för helgenomsekvensering. Kvantifiera effekten av två handdesinfektionsmetoder. Förväntade resultat Metodik för metagenomiska studier av virus och mikroorganismer på händer, ytor och i komplexa matrix kommer att tas fram. Specifikt kommer en metod för extraktion av RNA och DNA från virus och mikroorganismer i komplexa prover att etableras och därefter appliceras i en handtvättsstudie. Sequence assembly Bioinformatics Community identification De-novo or mapping assembly

19 Helgenomsekvensering av mikrobiom? Kartläggning av virus, Arkèer, bakterier, svampar (jäst och mögel)! = Förutsättningslös identifiering av mycket komplexa samhällen Utmaning att isolera både RNA och DNA från virus samt DNA från mikroorganismer. Kan kräva att flera sekvenseringar kombineras Stora mängder data och metadata skapas Ytterligare mer avancerad bioinformatik Metadata skapar etiska dilemman Erbjuder möjlighet att finna oanade samband

20 Mikrobiologins tekniksprång?! Erik Nygren Microbiology and Process hygiene SP Food and Bioscience Dr. i medicinsk mikrobiologi 10 års erfarenhet av prekliniskt och kliniskt arbete rörande diarrésjukdomar och orala vaccin. = Huvudsakligt intresse: Spridning av patogena och produktförstörande mikroorganismer i samhället, i produktionsanläggningar och mellan individer.

21 Virologi - studier av virus Acellulära, obligata intracellulära parasiter. Ggrundläggande strukturen hos ett virus - en bit av nukleinsyra (RNA eller DNA) som innesluts av ett proteinhölje (kapsid); inte har någon kärna, organeller, cellmembran, eller cytoplasman. storlek - 1/10 till 1/1000 storleken på en vanlig bakteriecell. icke motila