Optimerat NGS-flöde för rutintypning av bakterier

Storlek: px

Starta visningen från sidan:

Download "Optimerat NGS-flöde för rutintypning av bakterier"

Rickard Andreasson
för 8 år sedan
Visningar:

1 Optimerat NGS-flöde för rutintypning av bakterier Paula Mölling, Molekylärbiolog, Docent Bianca Törös, Daniel Golparian, Sara Thulin Hedberg, Paula Mölling Laboratoriemedicinska länskliniken, Molekylärdiagnostik & FOU, Universitetssjukhuset Örebro

2 NEXT GENERATION SEQUENCING (NGS) Referensgenom massiv parallell sekvensering

3 MISEQ - ILLUMINA Bibl. prep 2-4 h hands-on 4-6 h MiSeq sekv 20 min hands-on 1-2 dygn Analys Helt automatiserad på MiSeq eller alt. mjukvara 1 h - 1 dygn

4 MISEQ - ILLUMINA Sekvenseringsteknologi Illumina

5 MISEQ - ILLUMINA Ex. MiSeq körning: MiSeq reagent v3.0 (600 cycle)

6 MISEQ - ILLUMINA Flödesschema - NexteraXT DNA extraktion Tagmentering PCR-amplifiering PCR-rening Normalisering (kulor) Normalisering (mät fluorometriskt/qpcr) Poolning MiSeq Kritiska steg för hög kvalité och jämna NGS data

7 MISEQ - ILLUMINA DNA extraktion: kvalité + mängd Resuspendera ¼ dels blå ögla av bakterier i 1 ml NaCl Automatisk: QIASymphony DSP Virus/pathogen MIDI kit med RNAase (Qiagen) Eluera i Tris-HCL utan EDTA Manuell: Wizard Genomic Purification Kit (Promega) Eluera i Tris-HCL utan EDTA Ev. NanoDrop: 260/280=1.8-2 och 260/230= ~2 1µL prov per extraktionsbatch på gel (1% agaros) Bra kvalité Qubit 2.0 Fluorometer (Invitrogen) Späd i två steg ner till 0,2 ng/µl i 10 mm Tris-HCl Mät mellan spädningarna: Qubit Broad range dsdna kit (Molecular Probes) 2 ng/µl Qubit - High Sensitivity dsdna kit (Molecular Probes) 0,2 ng/µl Exakt mängd enl kit: 1 ng (5µL)

8 MISEQ - ILLUMINA Tagmentering >1 ng DNA / kort tagmenteringsstid minskad fragmentering (för långa fragment) <1 ng DNA / lång tagmenteringstid ökad fragmentering (för korta fragment) Optimerat till: 0,75 ng DNA (istället för 1 ng) 7,5 min tagmenteringstid (istället för 5 min)

9 MISEQ - ILLUMINA Normalisering utan kulor 1. Kvalitetscheck av biblioteket Bioanalyzer, High Sensitivity DNA kit (Agilent) 1 µl ospätt bibliotek Figuren visar ett lyckat sekvenserat bibliotek. Ett typiskt bibliotek visar en distribution från ~250 bp till 1000 bp men även fragment upp till 1500 bp går att sekvensera.

10 MISEQ - ILLUMINA Normalisering av varje prov Kulbaserad normalisering qpcr Qubit

11 MISEQ - ILLUMINA Optimerat flödesschema - NexteraXT DNA preparation (mät fluorometriskt) QiaSymphony prep Qubit-mät exakt till 0,75 ng Tagmentering 7,5 min tagmentering PCR-amplifiering PCR-rening Normalisering (kulor) Normalisering (Bioanalyzer, mät fluorometriskt) Kolla fragmentstorlek samt Qubit-mät varje prov Poolning (mät fluorometriskt) Qubit-mät poolen MiSeq

12 DATA ANALYS QC kontroll: Kvalitetscheck på sekvenserna FastQC (Illumina BaseSpace App) Assembly: Lägga ihop sekvenser till contigs assembla - contigs.fasta SPAdes (Illumina BaseSpace App), CLC Genomics Workbench, Velvet Optimiser m.fl. Extrahera fintypningsdata: Databaser för typning av bakterier Meningokocker: Bacterial Isolate Genome Sequence Database, BIGSdb S. aureus: Ridom SeqSphere+ ESBL: Center for Genomic Epidemiology (ResFinder, MLST etc) Diagnostics: full resistance profile + treatment suggestions in 15 min

13 DATA ANALYSIS Coverage = (PF Reads x % antal reads för resp isolat x antal cycler totalt ) / genomstorlek

14 DATA ANALYS BIGSdb = Bacterial Isolate Genome Sequence Database Neisseria locus/sequence definitions database Extract finetype from whole genome data Assembled FASTQ file

15 Kostnadsberäkning samt användningsområden av NGS för rutindiagnostiken på vårt lab Metod Tidsåtgång Pris MLST + 4 gener Sanger ~5 veckor / år ~ 2000 kr / prov NGS ~2 veckor / år ~ 600 kr / prov Rutinmässig genetisk typing - dagligen/veckovis * NEJ, inte för tillfället Epidemiologisk övervakning 2 / år Utbrottsundersökningar omedelbart JA JA *N. meningitidis + andra bakterier: N. gonorrhoeae, MRSA (ESBL, C.diff) JA

Genome-Based Characterization of Emergent Invasive Neisseria meningitidis Serogroup Y Isolates in Sweden from 1995 to 2012 Bianca Törös, Sara T. Hedberg, Magnus Unemo, Susanne Jacobsson, Dorothea M.C. Hill, Per Olcén, Hans Fredlund, Holly B.

5-1,2-2,36-2; F5-8; ST-23 Oxford (cc23); University 2-55; 25; 22 1995-2012 (n=185) Subtype 1 2006-2012 Subtype 2 1995-2012 Strain type YIII Strain P1.5-1,2-2,36-2; type YI F5-8; ST-23 (cc23); P1.

16 Genome-Based Characterization of Emergent Invasive Neisseria meningitidis Serogroup Y Isolates in Sweden from 1995 to 2012 Bianca Törös, Sara T. Hedberg, Magnus Unemo, Susanne Jacobsson, Dorothea M.C. Hill, Per Olcén, Hans Fredlund, Holly B. Bratcher, Keith A. Jolley, Martin C.J. Maiden, Paula Mölling Journal of Clinical Microbiology July 2015 Volume 53 Number 7 Illumina HiSeq, Strain type YII P1.5-1,2-2,36-2; F5-8; ST-23 Oxford (cc23); University 2-55; 25; (n=185) Subtype Subtype Strain type YIII Strain P1.5-1,2-2,36-2; type YI F5-8; ST-23 (cc23); P1.5-2,10-1,36-2; 3-36; 25; 1 F4-1; ST-23 (cc23); 3-36; 25; 22 NGS ger samma grova indelning som fintypning av de 12 generna YI består egentligen av två subtyper där Subtyp 1 är ansvarig för den stora ökningen av McY i sverige

17 SAMMANFATTNING NGS enorma möjligheter!!! Epidemiologisk typning, utbrottsutredningar, karaktärisera resistensmarkörer, identifiera okända organismer, hitta virulensgener, tumörpaneler, etc Begränsningar Dyrt, tar tid, bioinformatiskt kunnande saknas, ger enorma datamängder att hantera MEN Med optimerade biblioteksprepsprotokoll jämnare coverage per isolat - fler isolat kan poolas i samma körning billigare (inga omkörningar) Användarvänliga moln baserade mjukvaror och databaser ex BaseSpace, pubmlst.org reducerar behovet av bioinformatiskt kunnande för enklare typningsdata för klinisk diagnostik Automatiserad bibliotekspreparation: minimera hands-on och mer anpassat för rutindiagnostik!!!

18 Tack!

Relevanta dokument

Pilotstudie NGS: E. coli ESBL från patienter med misstänkt sepsis

Pilotstudie NGS: E. coli ESBL från patienter med misstänkt sepsis Helena Enroth, Med Dr (PhD), Klinisk molekylärbiologi, Unilabs, Skövde och Adj. Professor, Systems Biology Research Group, Inst. för biovetenskap,