Molekylärbiologisk diagnostik av tarmparasiter

Storlek: px

Starta visningen från sidan:

Download "Molekylärbiologisk diagnostik av tarmparasiter"

Jörgen Lundqvist
för 9 år sedan
Visningar:

1 Molekylärbiologisk diagnostik av tarmparasiter Vad, När, Var och Hur? Jessica Ögren Länssjukhuset Ryhov Juni 2012

2 Molekylärbiologiska metoder De senaste två decennierna har molekylärbiologiska tekniker i allt högre omfattning kommit till användning i diagnostiska sammanhang på våra mikrobiologiska laboratorier.

allt högre omfattning kommit till användning i

3 PCR för påvisning av tarmparasiter Feces är ett material som innehåller väldigt mycket av många olika saker Bra metoder krävs för att minska antalet inhiberande faktorer.

4 Hur? PCR-processen består av flera steg som alla måste fungera för optimal utdelning. Rätt provmaterial som hanteras på ett optimalt sätt Extrahera DNA ur cellen Amplifiera önskad målsekvens

5 Lysering av celler När det gäller cystor krävs en kombination av flera lyseringssteg.

6 Renframställning av nukleinsyra När cellerna lyserats och nukleinsyra frigjorts, har samtidigt också ett antal oönskade komponenter frigjorts. Med hjälp av magnetisk laddning, salter och ph-förändringar kan DNA skiljas ut från resten

7 PCR Till det renade DNA:t sätts en mastermix som består av bland annat primrar, prober, och enzymer.

8 PCR

9 Multiplex i Jönköping Under 2011 sattes en metod upp för att påvisa: Entamöba histolytica samt E.dispar Cryptosporidium spp Dientamöba fragilis Giardia lamblia

10 Metoden baserad på följande publikationer: Visser et al 2006: Diagnostic methods for differentiation of Entamoeba histolytica and Entamoeba dispar in carriers: Performance and clinical implications in a non-endemic setting Verweij et al 2003: Simultaneous detection of Entamoeba histolytica, Giardia lamblia, and Cryptosporidium parvum in fecal samples by using multiplex real-time PCR. Verweij et al 2007: Real-time PCR for the detection of Dientamoeba fragilis in fecal samples

al 2003: Simultaneous detection of Entamoeba histolytica, Giardia lamblia, and Cryptosporidium parvum in fecal samples

11 Etablering av multiplex-pcr Utveckling och anpassning till vår befintliga utrustning av: isoleringsmetoder för obehandlad feces och SAF fixerad feces lyseringsmetod DNA isoleringsmetod möjlighet för kvantifiering (odling av parasiter) Modifikation av PCR protokoll (reagenser, tider och volym) Omsättning från tre duplex PCR till två triplex PCR reaktioner per prov Modifikation av primer och prober Resultat datablad

möjlighet för kvantifiering (odling av parasiter) Modifikation av PCR protokoll (reagenser, tider och

12 Förbehandling En liten del tas från originalröret. Proven centrifugeras och de som innehåller SAF-lösning tvättas i två steg med PBS.

13 Lysering Svårigheter med cystor (speciellt Entamöba spp.) då dessa är väldigt tåliga Tillsats av Proteinase K och buffert -70 C 56 C -70 C 56 C -70 C 98 C

temperaturer Sätting av mastermix, templat (renad DNA) och

14 Flöde M48 DNA isolering Lysis renad DNA Slamma feces prov i lyseringsbuffer och proteinasek, lysering vid olika temperaturer Sätting av mastermix, templat (renad DNA) och försluter plattan med folie Sätta PCR plattan i LC480 PCR cycler

15 Resultat Drygt 1000 prov PCR betydligt känsligare när det gäller Dientamöba fragilis (115/140) och Giardia lamblia (20/27) Likvärdigt med mikroskopi när det gäller Entamöba histolytica/dispar (17/18) och Cryptosporidium spp (10/10).

(20/27) Likvärdigt med mikroskopi när det gäller Entamöba

16 Vad? De vanligaste patogenerna? (Giardia, Cryptosporidium, Entamöba histolytica och Dientamöba fragilis) Ovanliga svårdiagnostiserade parasiter (Strongyloides, flundror etc) De vanligaste kan vara föränderliga!

17 När? Screening Verifiering Vid negativ mikroskopi men fortsatt klinisk misstanke? Olika förutsättningar på olika laboratorium

18 Var? Överallt På få ställen

19 PCR vs Mikroskopi PCR är känsligare Mikroskopi är bredare PCR är en snabb analys Mikroskopi är snabbare PCR är automatiserad Mikroskopi är personberoende

20 PCR vs Mikroskopi PCR artbestämmer Entamöba histolytica/dispar Mikroskopi är billigare (än så länge) Kan PCR vara för känsligt. Eh kliniskt relevant? Kontaminationsrisk? Avdödade mikroorganismer?

21 Kvalitetssäkring! UkNeqas (eller annat?) har inget program. Flerlabb/trelabbssutbyte?

22 Tack för visat intresse!

23 Parasit PCR innebär påvisninga av: Åtskillnad av Entamoeba histolytica från Entamoeba dispar Dientamoeba fragilis Cryptosporidium arter (parvum/hominis) Giardia lamblia och en DNA prep/pcr inhibitions kontroll

24 Vi anpassade och utvecklade metoder på laboratorium med befintlig utrustning: Lysering för att släppa ut DNA från parasiter DNA isoliering och bortrening av störande komponenter från feces (PCR inhibitorer) Modifikation av PCR protokoll (reagenser, tider och volym) Omsättning från tre duplex PCR till två triplex PCR reaktioner per prov Modifikation av primer och prober Resultat datablad

25 Fungera bra på LightCycler480II och Applied Biosystems 7500FAST Multiplex realtids PCR Två Triplex reaktioner (TaqMan) Reaktion 1 / påvisning av: målgen Reporter färg Entamoeba histolytica 18S rrna (FAM) Entamoeba dispar 18S rrna (VIC) Dientamoeba fragilis 18S rrna (LC670=Cy5) Reaktion 2 / påvisning av: Cryptosporidium ssp. DNAJ-like protein gene (FAM) Giardia lamblia 18S rrna (YAK) IPC (DNA prep kontroll och inhibitionskontroll) 1 gb gene (LC670)

26 Detektionsgräns Dientamoeba fragilis plasmid spädning /1.000/100/10/1 kopior Entamoeba histolytica plasmid spädning /1.000/100/10/1 kopior

27 Rutin PCR Entamoeba histolytica Entamoeba dispar

28 Rutin PCR Dientamoeba Cryptosporidium

29 Rutin PCR Giardia lamblia IPC

30 Förbättringspotential Problem: - tillräckligt bra lysering av cystor? - Minimera lysering av DNA från oönskat material - utsläpp av ämnen, som kan inhibera PCR reaktionen - Förbättra snabbhet, enkel, effektiv och billig upparbetning av faeces

Relevanta dokument

Utvärdering av BD MAX enteric parasite panel på ett kliniskt laboratorie

Utvärdering av BD MAX enteric parasite panel på ett kliniskt laboratorie Georgina Isak a, Leigh Davidsson a, Stina Boräng b, Silvia Botero-Kleiven b a Enhet för parasitologi och vattenburen smitta, Folkhälsomyndigheten