HPV detekteringsmetoder

Transkript

1 HPV detekteringsmetoder Sydöstra IH-guppens möte m 2007 okt JönkJ nköping

2 Epidemiologi Cervixcancer Incidens/100000/år Sverige 10 USA (ACS) ca 10 Canada 10 Mortalitet/100000/år Ca 3 Ca 3,7 Ca 3 Ca nya fall/år r 80% i utvecklingsländer nder

3 Bakgrund Papovavirus fam. DNA virus HPV-s centrala roll i etiologin av cervical intraepitelial neoplasi Walboomers et al. 1999; Bosch et al, 2002; zur Hausen 2002

4 Bakgrund Cutana och mucosa associerade virustyper Mucosa-associerade onkogena typer ex 16 och 18

5 HPV-infektion HPV smittans frekvens i befolkningen 2/3 Symptom 10% Olika virustyper: lågrisk och högriskh virus olika kapacitet till neoplasiutveckling

6 Virustyper HR-HPV HPV ex. 16, 18,, 26, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 56, 58, 59, 68 LR-HPV ex. 6, 11, 40, 42, 53, 54, 57, 66, 84

7 Mekanismer i virusinfektionen Cellpåverkan HR-HPV E6 och E7 gener och relaterade proteiner degradering av p53 och prb >95% av skivepitelca i cervix innehåller HPV Watanabe et. al

8 Klinisk praxis - problemområden HPV diagnostik värdering av neg cytologi vs persistent infektion ASCUS Alternerande infektioner

9 Detekteringsmetoder HPV DNA baserad HPV mrna E6/E7 baserad

10 Detekteringsmetoder Detektering av viral nucleinsyra Target-amplifieringsmetod amplifieringsmetod Signal-amplifieringsmetod amplifieringsmetod

11 Detekteringsmetoder Target amplifiering Konsensus PCR: ett brett spektrum av HPV är amplifierad med sk konsensus primers, sedan detekterad med typ-specifika prober. Detektering och/eller genotyping av konsensus PCR produkter: hybridisering av inmärkta konsensus PCR produkter till typ-specifika oligos som är r fixerade till en filter.

12 Detekteringsmetoder Target amplifiering (forts.) Typ-specifik PCR specifika designade primers mrna amplifiering detektering av viral mrna som kodar för f r E6/E7. Reverse- transcriptase eller NASBA J. Compton 1991.

13 Detekteringsmetoder Signal-amplifieringsteknik amplifieringsteknik Liquid-phase signal amplifiering Hybrid Capture 2; HPV-Proofer Proofer.. Hybridisering av olika full-längd RNA prober till virus DNA detektering med peroxidas-märkta rkta antikroppar. Visualisering: fluorescent metod. Morfologisk signal-amplifiering amplifiering - ISH

14 Provtyper lämpliga för f target amplification metod 1. PCR baserad formalin-fixerat fixerat- paraffinbäddat, cellprov 2. LBC media organiskt lösningsmedel l måste m tas bort! 3. Digene Universal Collection Medium (UCM) fungerar 4. Provtyper för r mrna amplifieringsmetoder svårare att hitta media som bevarar mrna

15 Forskningsresultat Kate.S.Cuschieri et al., 2004: : HPV Type Specific DNA and RNA Persistence Implications for Cervivcal Disease Progression and Monitoring (Journal of Medical Virology) HPV-DNA genotypbestämning i patienter med negativ cytologi med påföljande follow up Detektering av HPV-DNA (typ specifik) och mrna E6/E7 transkriptioner vid follow up. Detektering av mrna E6/E7 transkriptioner mer specifik - roll i patient-selektering

16 Forskningsresultat forts. I Kraus et al., 2004: HPV in the dysplastic portio; An investigation of biopsies from 190 cervical cones (British J Cancer, 2004) HPV mrna analys med NASBA och jämförelse med konventionell PCR av HPV DNA

17 Forskningsresultat forts. Elisabeth I. Johnston et al., 2006.: Cytologic Diagnosis of Atypical Squamous Cells of Undetermined Significance in Perimenopausal and Postmenopausal Women (Cancer Cytopathology 2007) HCII HPV-DNA assay användbar ndbar metod förf patient-selektering med ASCUS dg

18 Forskningsresultat forts. Jack Cuzick et al.: Overview of the European and North American studies on HPV testing in primary cervical cancer screening (Int( J Cancer 2006) Jämförelse mellan HPV-test och cytologi avseende sensitivitet och specificitet; HPV test är r mer sensitiv än cytologi (96% vs 53%) men mindre specifik (90,7% vs 96,3%)i detektering av CIN2+ Resultat: rekommendation av primär r HPV-test med påföljande p cytologi vid positivt resultat. Obs! Ny strategi som kräver stora studier och utvärdering

19 p16 IH Stark nukleär r och cytoplasma positivitet i ett flertal tumörer, bl de cervixcancer E7 gene product (oncoprotein)) binder till och inaktiverar RB gene product Resultat: stark ökning av p16ink4a som kontrolleras via negativ feed-back av RB protein

20 p16 IH Uttryck av p16 protein är r associerad med HPV-s s onkogena potencial i cervixlesioner

21 p16 IH Färgningen: kärn- och cytoplasmafärgning intensitet homogenitet diffus fokal

22 Metodval Kong, Christina S. et al.: p16 INK4A Immunohistochemistry is Superior to HPV In Situ Hybridization for the Detection of High-risk HPV in Atypical Squamous Metaplasia Am J Surg. Pathol 2007; 31:33-43