) / (c l) -A R ) = (A L. -ε R. Δε = (ε L. Tentamen i Biomätteknik (TFKE37), 9 januari Uppgift 1 (10p)

Transkript

1 Tentamen i Biomätteknik (TFKE37), 9 januari Uppgift 1 (10p) För akronymerna FT- IR, AUC, AFM, UV och MALDI: a) Skriv ut förkortningen! b) Föreslå för varje metod två egenskaper hos biomolekyler som kan analyseras fördelaktigt med denna metod. Uppgift 2 (10p) Du finner nedan fyra algebraiska uttryck. Välj TVÅ av dessa uttryck och beskriv för dessa (och bara dessa!) så bra du kan: a) Vilken egenskap hos mätmetoden som beskrivs av detta uttryck b) Hur kan egenskaperna hos detta algebraiska uttryck hjälpa oss att förstå metoden och/eller tolka data/mätningar med denna metod? Δε = (ε L -ε R ) = (A L -A R ) / (c l)

2 Uppgift 3 (12p) Man har funnit att inhibitorer till MdmX- p53 interaktionen sänker livskraften hos cancerceller, vilket skulle kunna öppna upp nya möjligheter för läkemedelsdesign. För att utvärdera detta ytterligare har en forskargrupp satt upp en assay för att screena fram organiska molekyler som kan inhibera p53- MdmX- interaktionen. Använd figuren nedan för att besvara följande frågor: a) Vad är GFP? Vad borde BHQ1 vara för något? b) Förklara vilken strategi forskargruppen har valt för att screena sitt molekylbibliotek. c) Ge exempel på praktiska tips när man screenar ett stort bibliotek av föreningar och motivera varför fluorescens är ett bra val för en sådan screen. d) Varför sänks fluorescensintensiteten när man höjer koncentrationen av p53- proben? Förklara hur probdelen av p53 peptiden kan vara designad för att åstadkomma detta. e) Skissa ett diagram över vilka experimentella resultatkurvor du förväntar dig för en effektiv MdmX- interagerande, p53- inhiberande förening, och förklara/motivera varför du tror att resultatet borde se ut på detta sätt. Tsuganezawa, K., Nakagawa, Y., Kato, M., Taruya, S., Takahashi, F., Endoh, M., et al. (2013). A fluorescent- based high- throughput screening assay for small molecules that inhibit the interaction of MdmX with p53. Journal of biomolecular screening, 18(2),

3 Uppgift 4 (12p) I detta experiment studeras p53- bindningen av ett protein som är besläktat med MdmX och som kallas MDM2. Speciellt har man studerat vilken roll de N- terminala aminosyrorna hos MDM2 spelar för effektiv p53- bindning. a) Vilken metod har använts i figuren nedan? Namn och acronym, tack! b) Förklara hur experimentet utförts genom att beskriva responskurvornas utseende i figuren nedan. c) Vad visas i de små insatta figurerna? Vad representerar prickarna och linjen i dessa figurer? Hur använder du en sådan representation av data för att bestämma bindningskonstanter? d) Ett av experimenten visar en högre affinitet än det andra. Kan du, bara genom att titta på resultatkurvorna, föreslå en anledning till detta? Motivera ditt svar! e) Vad verkar vara rollen för de N- terminala aminosyrorna i MDM2 vad gäller p53- bindning? Hur kan detta påverkas av N- terminal fosforylering? f) Zhan, C., Varney, K., Yuan, W., Zhao, L., & Lu, W. (2012). Interrogation of MDM2 phosphorylation in p53 activation using native chemical ligation: the functional role of Ser17 phosphorylation in MDM2 reexamined. Journal of the American Chemical Society, 134 (15),

4 Uppgift 5 (10p) I detta experiment har en forskargrupp specifikt utvärderat det N- terminala p53- segment som binder MDM2 och funnit att mutationer i position 12 hos p53 påverkar bindningsstyrkan. Ett urval av experiment med mutationer i position 12 visas nedan. a) Vilken teknik har använts? Namn och akronym, tack! b) Förklara principen för denna teknik (beskriv utrustningen, hur utförs experimentet, vad mäts och hur, hur utvärderas data, vad är skillnaden mellan de övre och nedre panelerna nedan)! c) Baserat på resultaten som visas nedan, anser du att affiniteten ökade eller minskade vid mutation? Motivera genom att hänvisa till diagrammen. d) Vilken ytterligare skillnad kan du se när du jämför resultaten mellan p53ala och p53asn? Vad kan vara anledningen till denna skillnad? Brown, C. J., Dastidar, S. G., Quah, S. T., Lim, A., Chia, B., & Verma, C. S. (2011). C- terminal substitution of MDM2 interacting peptides modulates binding affinity by distinctive mechanisms. PloS one, 6(8), e Uppgift 6 (10p) I följande metoder beror responsen på massan hos den studerade biomolekylen: SPR, AUC, Fluorescence anisotropy, MALDI och SDS- PAGE. a) Beskriv för varje metod hur denna beror på molekylvikten och hur detta molekylviktsberoende detekteras experimentellt. b) Ange för varje metod en mass- relaterad metodspecifik fördel och en dito nackdel när det gäller studier av biomolekyler!

5 Uppgift 7 (16p) Proteinet p53 är nödvändigt för normal celltillväxt vilket gör att mekanismer som ökar dess nedbrytning genom proteosomal nedbrytning också ökar cancerrisken. I detta arbete föreslår en forskargrupp ett område för interaktioner för proteiner som är involverade i p53- nedbrytning och undersöker denna region genom mutationsstudier och biofysikaliska analyser. Regionen finns avbildad i bilden till höger, och resultaten från två av mutationerna visas nedan i figur A- C. a) Vilka metoder har använts nedan? Namn och akronymer tack! b) Förklara resultaten som erhållits i figur A- B. Hur erhöll man dessa kurvor? Vad skiljer i mätningarna om man jämför figur A med figur B? Vilken typ av information kan man få från dessa helt olika paneler? Hur kan man få fram och utvärdera denna information från rådata? c) Förklara resultaten som erhållits i figur C. Stämmer dessa resultat med resultaten i figur A+B? d) Jämför arbetsinsatsen som krävs i form av proteinprovberedning för experimenten i A- B jämfört med experiment C. Vilket experiment kräver mest med avseende på provförberedelser? Varför? e) Om man vill studera p53- interaktioner, vilken ytterligare information kan erhållas i det mer krävande experimentet? Förklara! Bernard, X., Robinson, P., Nominé, Y., Masson, M., Charbonnier, S., Ramirez- Ramos, J. R., et al. (2011). Proteasomal degradation of p53 by human papillomavirus E6 oncoprotein relies on the structural integrity of p53 core domain. PloS one, 6(10), e25981.