Omtentamen Biomätteknik, TFKE augusti 2014

Transkript

1 Omtentamen Biomätteknik, TFKE37 29 augusti 2014 Kursansvarig: Professor Maria Sunnerhagen, Molekylär bioteknik, IFM Tillåtna hjälpmedel: linjal, räknedosa (krävs dock ej för tentan). Var noga med att förklara vad du menar, enbart stödordssvar kan aldrig ge full poäng (förutom när enstaka fackord/tekniker uttryckligen efterfrågas). Använd korrekt fackspråk där så är möjligt! Om det känns enklare: skriv gärna ihop delfrågorna (a,b,c ) inom varje fråga som en helhet eller disponera om svaret på det sätt du finner bäst. Viktigast är att alla delfrågor besvaras. Lycka till! Maria Uppgift 1 (10p) Som en uppvärmningsuppgift anges nedan mätenheter som används inom någon av de metoder vi gått igenom men vilken? Ange metodnamn, eller akronym+uttydning av denna, samt ett exempel på vad metoden kan mäta för egenskap hos ett protein/biomolekyl (max två meningar) för varje deluppgift. Metoderna behöver inte beskrivas ytterligare. a) ppm b) pn c) m/z d) e 280 e) r(t)

2 Inledning till fråga 2-6 Två stycken PhoB-DBD protein-domäner binder till två konsekutiva regioner på DNA, som i detta arbete kallas Mm (Major-minor). Temat med två DNA-bindande site för samma protein förekommer ofta hos eukaryoter. Att klargöra hur denna bindning fungerar är viktigt för att kunna förstå genreglering och felaktigheter i denna, vilket är kritiskt för bland annat cancerutveckling. I Ritzefeld et al. (Biochemistry 2013, 52, ) undersöker man PhoB-DBDbindningen till DNA ytterligare genom att föra in en randomiserad DNA-region som då kallas Xx. En oligonukleotid som kallas MmMm har alltså två kända proteinbindande motiv efter varandra (som i det blå motivet i figuren nedan). En oligonukleotid med namnet MmXx har bara ett proteinbindande motiv följt av en DNA-sekvens som är slumpmässigt sammansatt (alltså en blå Mm-modul följt av en Xx modul istället för ytterligare en Mmdel). PhoB- DBD Mm PhoB- DBD Mm a) Tredimensionell struktur av två PhoB-DBD-domäner bundna till ett MmMm-motiv. b) En schematisk skiss över samma struktur. Fråga 2 (12 p). Fyra muterade proteiner (R176A, T217A, V218A samt Y223A) samt vildtypsproteinet (WT) analyserades. a) Vilken metod har använts nedan? Motivera ditt svar! b) Vilken information om proteinet kan du läsa ut genom att jämföra resultaten för de olika proteinerna med varandra? c) Diskutera det experimentella resultatet med tanke på proteinets tredimensionella struktur (ovan). Stämmer resultatet med strukturen?

3 Fråga 3 (12 p) Bindningen till DNA för vildtypsproteinet och tre av mutanterna analyserades vidare med ytterligare en teknik. Resultat visas och beskrivs i figur och figurlegend nedan. a) vilken teknik? Namn och akronym tack! b) Beskriv hur tekniken använts i detta fall. Rita gärna en skiss. Ledfrågor: Hur är experimentet uppsatt/designat? Vad inträffar vid de olika tidpunkterna i diagrammen nedan? c) Vilka mutanter binder inte alls till vildtypsdna? Motivera ditt svar utifrån figuren nedan. d) Vilka mutanter binder till vildtypsdna men inte till DNA där man randomiserat den ena bindningsregionen? Hur ser du detta utifrån data? e) Är minskningen i bindning för dessa mutanter (de som du angett i svaret på d ) så stor som du skulle förväntat dig? Motivera ditt svar! f) Vad kan detta bero på? (2 bonuspoäng för bra förslag på denna fråga!) Figure Legend. Sensograms of the interaction between Pho-DBD and the oligonucleotides MmMm and MmXx. The proteins R176A (A), T217A (B, C), V218A (D, E) and Y223A (F) were used as analytes at different concentrations between 100 and 0.5 µm in the case of the point mutants and 10 and 0.05 µm in the case of the dimers, respectively. All sensograms display both runs of every analyte concentration colored in black and grey, to show the reproducibility of the method.

4 Fråga 4 (12 p). Bindningen mellan Pho-DBD och DNA för vildtypsprotein och DNA analyserades vidare med hjälp av tekniken nedan. into buffer into MmMm a) Vilken metod har använts? Namn och akronym, tack! b) Beskriv vad som visas i den övre panelen. Förklara hur dessa signaler har uppkommit och varför de ser olika ut för de två fallen (grått/ och svart/u). c) Beskriv vad som visas i den undre panelens figur. Hur har man erhållit dessa data från den övre panelen? d) Förklara vad som menas med den tabell som visas till höger om den undre figuren och förklara hur man erhållit dessa värden. e) Vilka slutsatser kan du dra från mätningen och de värden som erhållits?

5 Fråga 5 (12 p). För att ytterligare undersöka bindningen mellan PhoB-DBD och DNA användes tekniken nedan. Figure Legend: (A) Emission and excitation spectra of the pure wt-phob-dbd proteins labeled with carboxyfluorescein (PhoB-CF; blue) and Atto 550 (PhoB-Atto550; red) (excitation wavelengths: 488 and 554 nm, emission wavelengths: 524 and 579 nm) (D) Emission spectra of the protein DNA complexes consisting of different ratios of protein (1:1 mixture of PhoB-CF and PhoB-Atto550) and the oligonucleotide MmMm. For comparison, the spectra of the protein MmXx complexes are displayed (emission wavelength: 470 nm). a) Vilken teknik har använts? Namn och akronym! b) Gör en skiss som beskriver den fysikaliska bakgrunden för experimentet och beskriv denna. c) Förklara hur proteinernas egenskaper som visas i A är kritiska för experimentets genomförande. d) Beskriv och tolka resultaten av experimenten i D! Fråga 6 (12 p) När man gått igenom experimenten i fråga 1-4 ställer man sig frågan om PhoB-DBD bildar en interagerande dimer när det bundit till DNA eller om det binder DNA som självständiga monomer, oberoende av varandra. a) Redovisa två argument för eller mot en interagerande dimerisering i experimenten i fråga 1-4! b) Välj ytterligare en metod som du kan använda för att undersöka dimerisering av PhoB-DBD i frånvaro och närvaro av DNA! c) Beskriv det/de experiment du skulle vilja utföra med den valda metoden och vilken typ av resultat du förväntar dig av detta/dessa!

6 Fråga 7 (10 p) a) Vilken metod har använts vid mätningarna nedan? b) Varför används just detta mätområde för proteiner? Motivera! c) Vilka biomolekylära system är denna metod viktig för? Nämn 2 och motivera! Nu är tentan slut! Hoppas ni haft en trevlig stund! Varma h Maria