Övergångar mellan vibrationsnivåer i grundtillståndet. Infraröd spektroskopi

Transkript

1 Övergångar mellan vibrationsnivåer i grundtillståndet Infraröd spektroskopi

2 Lägre energier än VIS

3 Infraröd spektroskopi Övergångar mellan vibrationsnivåer i grundtillståndet Intensiteten är relaterad till övergångsdipolmomentet Dikroism kan observeras i orienterade tillstånd Polymerer ger nya egenskaper i spektra jfrt monomerer pga koppling mellan näraliggande övergångsdipolmoment

4 Intensiteten av ett vibrationsabsorbtionsband beror på storleken av övergångsdipolmomentet. μ ba = <Ψ b μ Ψ a > Hur ser vågfunktionerna ut för grundtillståndet och det exiterade vibrationstillståndet? OBS: Vi måste ta hänsyn till både kärnor och elektroner för vibrationsövergångar, eftersom det är kärnorna som vibrerar! v v Ψ(r e, r n )

5 Born-Oppenheimer-approximationen Vi kan dela upp den totala vågfunktionen i ψ för elektronernas och N för kärnornas bidrag (r e : elektronkoordinater, r n : kärnkoordinater). Då kan vi skriva vågfunktionen som Ψ (r e, r n ) = ψ (r e, r n ) N (r n ) och övergången som ψ (r e, r n ) N v (r n ) ψ(r e, r n ) N v (r n ) Tillstånd v Tillstånd v

6 Intensiteten av ett vibrationsabsorbtionsband beror på storleken av övergångsdipolmomentet. μ ba = <Ψ b μ Ψ a > Hur ser vågfunktionerna ut för grundtillståndet och det exiterade vibrationstillståndet? OBS: Vi måste ta hänsyn till både kärnor och elektroner för vibrationsövergångar! Born-Oppenheimer-approximationen: Vi kan dela upp den totala vågfunktionen i Ψ för elektronernas och φ för kärnornas bidrag (r: elektronkoordinater, R: kärnkoordinater). Då kan vi skriva övergången som

7 Om kärnorna står still beror övergångsdipolmomentet endast av Ψ, och blir 0 eftersom φ v, v är ortogonala Men om kärnorna får vibrera kan man visa med hjälp av taylorutveckling att väntevärdet blir följande: Ändringen i dipolmoment då kärnorna ändrar läge

8 Om kärnorna står still beror övergångsdipolmomentet endast av Ψ, och blir 0 eftersom N v,n v är ortogonala ψ*n v * μ ψ N v dτ = ψ* μ ψ dτ N v * N v dτ Men om kärnorna får vibrera kan man visa med hjälp av taylorutveckling (där q = 0 är kärnornas jämviktsposition) att väntevärdet blir följande: ψ*n v * μ ψ N v dτ = ψ*[δμ(r e )/δ q] q=0 ψ dτ N v * q N v dτ ändringen i dipolmoment då kärnorna ändrar läge Om molekylens dipolmoment ändras under vibrationen sker alltså IR-absorbtion!

9 Om molekylens dipolmoment ändras under vibrationen sker alltså IR-absorbtion: Klassisk analogi: μ = qr, δμ/δr = q R +q -q Ju större laddningar, desto större dipolmoment desto större absorbtion!

10 Biomolekylära IR absorbtionsband

11 Vi kan se ändringar i molekylbindningskaraktär Identifiering av syntetiserade substanser (-OH, -COOH, -COH) Karakterisering av material (de flesta absorberar IR) Kovalenta bindningar: enzymatiska omvandlingar Icke-kovalenta bindningar: vätebindningar Isotopshift ( 1 H mot 2 H) Hydrofoba bindningar: membraner, lipider Proteinstrukturer Biomolekylära interaktioner

12 Hur ser provcellen ut? Mätningar i KBr pellet: enklast I lösning: fysiologiskt, dock H 2 O- absorbtion Välj fönster med omsorg! Måste vara transparenta (BF,CaF, ZnSe, NaCl osv) Kyvettlängd ~6 μm ATR (attenuated total reflection): En film av proteinet eller membranytan läggs på IRSkristallen

13 Vatten-effekter

14 IR FT-IR Svepa över våglängdsområdet med en våglängd i taget Antal lyckade experiment är få Fourier Transform - teknik Varje experiment lyckas! Stort antal exp för att täcka våglängdsområdet Lågt signal/brus Tar tid de flesta experiment ger inget resultat Ett accord av frekvenser Vi får snabbt ett resultat! Summering av många experiment ger hög känslighet

15 Första experimentella bekräftelserna på Watson-Crick basparning kom från IR-spektroskopi A+U G+C GC AU

16 1:1 binding av baser: bevis från IR-titreringar VanHolde s 455

17 Linjärpolariserat ljus har stor användning inom IR, eftersom vi kan orientera våra prover på provcellen : A II och A kan relateras till den molekylära orienteringen.

18 Linjärdikroism för orienterade DNA-molekyler Vilken kurva visar T och vilken visar T II med helixaxeln?

19 Linjärdikroism för orienterade DNA-molekyler ger stigningsvinkeln T : T II : VanHolde s 471 Vibrationer i bas-planet ger större absorbans/minskad transmittans då ljuset är polariserat parallellt med baserna (vinkelrät mot helixaxeln) eftersom det då är parallellt med övergångsdipolmomentet. Ur skillnaden mellan T II och T kan vinkeln mellan basplanet och helixaxeln beräknas.

20

21 Kovalenta bindningar: intermediat och produkter i enzymatiska reaktioner Barth et al., JBC 1997 Differensspektra av två Ca2+-release reaktioner från fosforylerat (tunn linje) och icke-fosforylerat ATPas (tjock linje)

22 Tidsupplösta spektra ( ms diff) av bakteriorhodopsins olika ljus-inducerade fotointermediat

23 Kan struktur avläsas? Poly-g-benzyl-L-glutaminsyra Heldragen linje: ljus polariserat parallellt med fiberriktningen Streckad linje: polariserat ljus ortogonalt mot fiberriktningen Tsuboi, J. Poly. Sci., 1962

24 Hur känsligt är IR för sekundärstruktur? β-sheet Random coil α-helix

25 Övergångsdipolernas samverkan eller motverkan gör övergångarna tillåtna eller förbjudna Antiparallellt β-sheet α-helix Miyazawa, J Chem Phys, 1960 D 10 > D 30 > D 20

26

27 Hur utvärdera sekundärstruktur? -Utvärdering av andraderivatan -Fourier self-deconvolution (spectral deconvolution)

28 Exempel på utvärderingsprocess Steg 1 Steg 2 irreguljär β-sheet Olika sorters β-sheet

29 Membranproteiner vi kan studera både proteinet β-sheet/turn α-helix Dynamic / 3 10 helix Random coil Dynamic/3 10 -helix Bundle Monomer

30 och dess effekt på lipiden ATR dikroism spektra av multibilayer utan och med protein: en organisering! Sal-Man et al., Biochemistry 2002, Preassembly of membrane active peptides is an important factor in their selectivity toward target cells.

31 Denatureringar Nativt tendamistat: denatureringsmittpunkt 82 ºC Muterat tendamistat: Lägre denatureringstemp, aggregering vid högre temperaturer

32 Vilken ger differensspektra?