NMR en mångsidig biomätteknik

Transkript

1 NMR en mångsidig biomätteknik Maria Sunnerhagen, IFM NMR fundamenta Proteinspektra i en och flera dimensioner Resonanstilldelning Strukturbestämning Ligandmappning, SAR-by-NMR Folding och dynamikstudier Jämförelse med övriga biomättekniker

2 NMR fundamenta från ett kvantmekaniskt perspektiv Vissa atomkärnor besitter en egenskap spinn, karakteriserat av spinnkvantalet I, som predikterats från relativistisk kvantteori. 1 H: I=½ 12 C: I=0 14 N: I=1 16 O:I=0 31P: I= ½ 2 H: I=1 13 C: I= ½ 15 N:I= ½ 17 O: I=5/2 Om vi sätter dessa atomkärnor i ett magnetiskt fält kommer de att på ett kvantiserat sätt anta tillstånd med olika energi: I= ½ ger två tillstånd: ψ = α, ψ = β ε Ökande yttre magnetiskt fält B o

3 Kan vi få kärnorna att byta tillstånd? Prediktion: ja, genom att applicera ett störfält 2B 1 cos ωt vinkelrät mot B o. Tidsoberoende Schrödingerekvationen ger tillstånd i system där väntevärdet är tidsoberoende. H Ψ = E Ψ För utvecklingen av systemet med tiden måste man titta på tidsderivatan : den tidsberoende Schrödingerekvationen iћ dψ / dt = H Ψ För UV/VIS-spektroskopi är Einsteinkoefficienterna, som bestämmer storleken på sannolikheten för transitionsövergång, proportionella mot μ ba = <Ψ b μ Ψ a >, övergångsdipolmomentet.

4 Kan vi få kärnorna att byta tillstånd genom ett magnetiskt störfält? För att kunna räkna på övergångar mellan kärnspinn måste vi introducera en spinnoperator i hamiltonoperatorn H(t)= 2 γ ћ B 1 I x cos ωt men lösningen av de tidsberoende och tidsoberoende Schrödingerekvationerna med denna operator tillsammans med lite störningsteori ger sannolikheten P ab för övergång P ab = 2π/ћ <α H β> 2 δ (ε α - ε b -hν) där δ (x) är 1 när x=0 och annars 0, alltså Δε = hν

5 Hur kan vi applicera ett störfält 2B 1 cos(ωt)? Jo, genom den magnetiska delen av ljus! Energiskillnaden mellan tillstånden är mycket liten, vilket ger låga frekvenser och långa våglängder - radiovågor Nuclear Magnetic Resonance Kärnmagnetisk resonans

6 The Nobel Prize in Physics 1952 "for their development of new methods for nuclear magnetic precision measurements and discoveries in connection therewith" Felix Bloch Stanford University USA Edward Mills Purcell Harvard University, USA Each atom is like a subtle and refined instrument, playing its own faint, magnetic melody, inaudible to human ears. By your methods, this music has been made perceptible, and the characteristic melody of an atom can be used as an identification signal. This is not only an achievement of high intellectual beauty - it also places an analytic method of the highest value in the hands of scientists. (prof Harald Cramér, Kungl Vetenskapsakademin)

7 Utrustning för NMR Prober Användarterminal, pulsprogrammeringsenhet Puls- och vågformsgenerator, gradientenhet, styrenheter Supraledande, kväve/heliumkylda magneter

8 Vad kan vi få för biomolekylär information? Isotopshift Kemiskt shift...beror av kärnans lokala omgivning

9 SÄTT IN SPEKTRUM En spektroskopisk metod där vi kan studera atomer i olika aminosyror! men hur vet vi vilka signaler som hör till vilken atom???

10 Richard Ernst Nobel laureate 1991, ETH, Zürich Fourier-transform NMR ökar känsligheten genom att antal lyckade experiment per tidsenhet ökar Continuous Wave (CW-NMR) Fourier Transform (FT-NMR) Antal gjorda exp Antal lyckade exp Accord av rw Varje exp lyckas!

11 Richard Ernst Nobel laureate 1991, ETH, Zürich Överföring av magnetiseringsrelaterade egenskaper mellan olika tillstånd och kärnor Ger möjlighet till komplicerade experiment i flera dimensioner!

12 Resonanstilldelning (vilken topp hör till vilken atom) Folding Ligandbindning Struktur Dynamik

13 Flerdimensionell NMR: kärnspinn kan påverka varandra - vi kan överföra frekvensmärkt information mellan grann-atomer Ile 35 Tänk dig 1Dspektrumet på diagonalen! Korstoppar talar om vilka atomer som ligger nära varandra i rymden och/eller i proteinsekvensen Tyr 52

14 Kärnspinnen kan påverka varandra genom koherens spinnrelaxation (noe) spinnväxelverkan medierad av bindningselektronerna kräver kemisk binding olika kärnor påverkar varandra genom rymden då de relaxerar till grundtillståndet avståndsberoende (< 5Å), ~ 1/r 6

15 Kurt Wüthrich Nobel laureate 2002 ETH, Zürich

16 Grx4, 115 aa, potentiell beskyddare mot cancer men hur ser den ut??? NOESY visar alla nära kontakter (< 5Å) mellan de atomer som finns representerade på diagonalen. OM vi visste resonanstilldelningen (vem som är vem) skulle vi kunna beräkna strukturen!

17 Magnetisk märkning

18 15N-märkning av Grx4 ger enklare spektra NOESY ger alla avstånd < 5Å HSQC en aminosyra per topp 1H 1H 1HN 15N 1HN

19 och möjlighet till 3D HN 35 HN 48 HN 66 HSQC-sidan HN H N 1HN 2D-NOESY 2D-plan ger noe-er för en aminosyra! 1HN 3D-NOESY-HSQC

20 Typiska sekundärstruktur-noe-er α-helix β-strands, β-sheets, β-turns

21 NMRstrukturer beräknas iterativt och ger en strukturfamilj konsistent med indata

22 NMR-struktur av Grx4 Active site loop Output från rådata Förfinat med MD-simulering

23 Veckat eller oveckat protein? 1D-spektra HSQC

24 Ligandbindning analyseras enklast i HSQCspektra där man har en aminosyra per topp Binding av cancerinhibitorn chalcone till MDM2 Stoll et al., Biochemistry 2001

25 shiftändringar pga ligandinteraktion eller strukturförändring I det undre fallet påverkas även strukturen av ligandbindningen

26 SAR-by-NMR Identifiera två ligander som binder till intill-liggande sites på proteinet, genom att screena effekten på HSQC spektra! Koppla ihop liganderna! Mät den nya affiniteten!

27 Dynamikstudier Relaxationshastigheten hos NMRsignalen påverkas av rörligheten kring atomen. Ur detta kan man bestämma ordningsparametrar rörelsens frekvens Skilja på rörlighet och oordning i strukturen

28 15 N-relaxation ger information om dynamik hos proteiner active sites är rörliga! DHFR, Dyson,Wright and coworkers

29 Jämförelse med övriga biomättekniker Tekniskt och fysikaliskt avancerad Ger en mängd unik information Höga provkrav map mängd, renhet och inmärkning (genetiskt uttryckt material) Utvärdering av data kräver expertkunskaper Bäst i samband med annan biofysikalisk utvärdering Höga kostnader - läkemedelsindustri

30 UPPLÖSNING X-ray MALDI CD Antikropp UV IR Analytisk ultracentrifugering NMR fluorescens Probe-tekniker Stopped flow Biacore Kalorimetri DYNAMIK

31 Jämförelse med kristallografi Lösning Proteiner mindre än 250 aa Dynamik Allt syns oavsett struktur Snabba ligandstudier Okristalliserbara tillstånd Kristall Även stora proteiner/komplex Frusna tillstånd Endast ordnade strukturer synliga Kompletterar varandra!