Försättsblad till skriftlig tentamen vid Linköpings Universitet

Transkript

1 Försättsblad till skriftlig tentamen vid Linköpings Universitet Datum för tentamen Sal TER1 Tid Kurskod TFKE37 Provkod TEN1 Kursnamn/benämning Provnamn/benämning Biomätteknik Skriftlig tentamen Institution IFM Antal uppgifter Åtta (8) (som ingår i tentamen) Jour/Kursansvarig (ange vem som besöker salen) Maria Sunnerhagen, professor Telefon under skrivtid 6682 el Besöker salen ca kl , Kursadministratör Rita Fantl / 1381/ ritfa@ifm.liu.se Tillåtna hjälpmedel Räknedosa, linjal Övrigt (exempel när resultat kan ses på webben, betygsgränser, visning, övriga salar tentan går i m.m.) Vilken typ av papper ska användas, rutigt eller linjerat Antal exemplar i påsen 43 Redovisa beräkningar och motiveringar Rutigt

2

3 SVENSK VERSION (English version follows) Var noga med att förklara vad du menar, enbart stödordssvar kan aldrig ge full poäng (förutom när enstaka fackord/tekniker uttryckligen efterfrågas). Använd korrekt fackspråk där så är möjligt! Om det känns enklare: skriv gärna ihop delfrågorna (a,b,c ) inom varje fråga som en helhet eller disponera om svaret på det sätt du finner bäst. Viktigast är att alla delfrågor besvaras Uppgift 1 (15p) SPR AFM FRET MALDI FT-IR a) Uttyd akronymerna b) Beskriv kort vad som kan mätas med de olika metoderna c) beskriv för varje metod någon egenskap hos biomolekyler som man kan studera med metoden (max 2 meningar per metod). Uppgift 2 (8p) De matematiska uttrycken/ekvationerna nedan hänger ihop med varsin bild. a) Ange vilka uttryck och bilder som hänger ihop, motivera ditt svar. b) Vilka biomättekniker är relaterade till dessa uttryck? c) Förklara vad ekvationen beskriver med hjälp av bilden och hur det hänger ihop med mättekniken. Relatera till minst en av de storheter som beskrivs i ekvationen. Ekvation A Ekvation B Bild A Bild B

4 UPPGIFT 3 (12p) I experimentet nedan har man mätt bindningen av olika fettsyror till de fettsyrabindande proteinerna Mp1p och DBD2 (Liao et al., JBC 2010, 285, ). Det övre diagrammet visar resultat från mätningen med Mp1p och palmitinsyra. Tabellen beskriver resultat från alla utförda experiment; n anger antalet bindningssites för fettsyran på proteinet uppskattat från mätdata. a) Vilken metod har använts? Ange akronym och uttydning. b) Vad borde stå på axlarna i det övre diagrammet? c) Förutsatt att titreringarna görs med samma protein- och ligandkoncentrationer och samma buffertar, vilka två skillnader skulle vara uppenbara om du skulle jämföra palmitinsyra-titreringar med Mp1p och LBD2? Skissa gärna hur diagrammen skulle se ut jämfört med varandra för att illustrera ditt svar. d) Hur kommer det sig, tror du, att n i mätningarna med muterat LBD2 är mindre än 1? Har du något förslag till forskarna för att förbättra mätningarna så att n blir ett heltal? e) Vilken metod har använts i resultaten nedan? Ange akronym och uttydning. f) Förklara skillnader och likheter mellan denna metod och metoden i a-d ovan.

5 UPPGIFT 4 (10p) Matrix-domänen (MA) hos HIV-proteinet Gag spelar flera olika roller i den virala replikationscykeln, som är associerat med olika bindningspartners. När MA-proteinet myristoylerats dvs modifierats med en fettsyra binder det RNA som ett kamouflage för att inte binda ospecifikt cellmembran innan PrGag-komplexet levereras till plasmamembranets monteringsplats för viruspartiklar. (Alfadhli et al., JMB 2011, 410, Bindningsstyrkan av MyrMA till RNA har analyserats i ett experiment vars resultat redovisas nedan. I experimentet tv har man analyserat binding av fluorescensmärkt Sel25 RNA medan man i experimentet th utökat studien och även analyserat binding av molekylerna PSC6 och PIP2C8. Measurements were conducted using 5 nm FITC-labelled Sel25 RNA in buffers at the indicated ph value. Assays were performed with 5 nmfitc-sel25 and 1 μm MyrMA plus increasing concentrations of untagged Sel25, di-c6 PS (PSC6), or PIP2C8. Measurements were obtained in triplicate, and dissociation curves were fitted to exponential decay best-fit curves. a) Vilken metod har använts för dessa experiment? b) Vad är FITC, tror du? c) Förklara hur experimenten designats och varför signalerna ökar/sjunker. d) Kan man använda resultaten till höger för att mäta affiniteten av de olika liganderna? Förklara hur! e) Finns det situationer där man har bindning till MyrMA utan att man får signal i experimentet till höger? Förklara! Ge förslag på ett kontrollexperiment.

6 Uppgift 5 (10p) I experimentet nedan har man analyserat komplexet mellan MyrMA och Sel15 (en kortare variant av Sel25). Man fick då bekräftat att bindningen hade stökiometrin 1:1. Samples of 10 μm FITC-Sel15 RNA only or 10 μm FITC-Sel15 RNA plus 4-fold molar excess of MA were prepared in 25 mm sodium phosphate (ph 7.8) and 50 mm NaCl. Equilibrium experiments were carried out at 16 C using 12-mm cells and 2-channel centerpieces at 20,000 rpm, monitoring the absorbance of the free and bound FITC-labeled RNA at 490 nm. a) Vilken metod har använts? b) Beskriv kort hur denna metod fungerar och hur resultat erhålls. c) Vilken alternativ metod skulle kunna använts för att få motsvarande data? Varför, tror du, har man föredragit att använda den valda metoden? d) Experimentet utvärderades genom att analysera absorbansen vid 490 nm. Diskutera varför detta gjordes och hur det kan ha förenklat tolkningen av resultaten. Uppgift 6 (5p) Med ytterligare en mätmetod har man fått följande resultat: A surface representation of the MA structure is shown. Residues that exhibited significant chemical shift changes (Δδ-HN 0.15 ppm) on Sel15 RNA binding are colored red. a) Vilken metod har använts? b) Beskriv tillvägagångssättet genom att göra en principskiss över hur det viktigaste experimentet ser ut (vad heter det? glöm inte enheter på axlarna) och hur det använts för att få fram resultaten ovan. c) Vilken annan typ av information måste finnas för att man ska kunna tolka de data som fås ur experimentet du beskrev i b)?

7 Uppgift 7 (12p). Forskarna vill nu gärna gå vidare och mäta påverkan på struktur och stabilitet hos MyrMA både i fritt tillstånd och i membranet, i närvaro och frånvaro av RNA. Föreslå lämpliga tillvägagångssätt och metoder för detta! Tänk på följande: - två metoder ska användas, motivera ditt val - vad ska mätas? Med vilken utrustning? (vad finns på axlarna)? - beskriv översiktligt (rita skiss) hur data kan se ut från dessa mätningar - förklara kort hur data kan utvärderas. Uppgift 8 (8p) Det har nu gått 6 år, och man har utvecklat ett HIV-proteinläkemedel baserat på studier kring MA och dess interaktioner. Som nyutexaminerad KB-student har du blivit rekryterad in i en grupp forskare och utvecklare som ska ta proteinläkemedlet till produkt. Din nya chef, som är molekylärmedicinare, har nu bett om dina synpunkter. Vilka problem ser du? Välj TVÅ problemområden och diskutera hur man ska kunna använda olika biomättekniker för att garantera att produkten kan användas säkert av patienter. Lycka till! Maria

8

9 ENGLISH VERSION Be careful to explain what you mean, only single words can never give full credits (except when single techniques or terms are explicitly asked for). Use correct professional and scientific language wherever possible! If it feels easier for you: feel free to combine questions (a,b,c ) within each exercise as you find best. The most important is that all questions are answered Question 1 (15p) SPR AFM FRET MALDI FT-IR a) Spell out the acronyms above b) Describe briefly what can be measured with the different methods c) Describe a property of biomolecules which can be studied using each method (max two sentences per method) Question 2 (8p) The mathematical expressions below each belong to one of the figures. a) State which expressions and figures belong together, motivate your answer. b) Which biomeasurement technologies are related to each expression? c) Explain what the equation describes using the figure, and how this is connected to the biomeasurement technology. Relate to one or more of the entities in the equation. Equation A Equation B Bild A Bild B

10 Question 3 (12p) In the experiment below, the researchers performed a binding analysis of lipid acids to the lipid acid-binding proteins Mp1p and DBD2 (Liao et al., JBC 2010, 285, ). The top diagram shows results from the binding experiment using Mp1p och palmitinsyra. The table describes the results of all the experiments; n gives the number of binding sites for the lipid acid on the protein as estimated from the measured data. a) Which method has been used? Give acronym and interpretation. b) What labels should be on the axes in the top diagram? c) Assuming that the titrations are made using the same protein- and ligand concentrations and the same buffers, which two differences would be obvious if you would compare palmitoleic acid titrations with Mp1p and LBD2? Feel free to outline graphically what the diagrams would look like for the two cases, compared to each other, to illustrate your answer. d) Why is n in the measurements with mutated LBD2 less than 1? Could you help the researchers improve the measurements so that an integer can be obtained? e) Which method has been used in the diagram below? Give acronym and interpretation. f) Explain briefly the similarities and differences between this method and the one used in a-d above.

11 Question 4 (10p) The Matrix-domain (MA) in the HIV-protein Gag plays various roles in the viral replication cycle, all of which are associated with different binding partners. When the MA protein is myristoylated which means that it has been covalently modified with a lipid acid it binds RNA as a kind of camouflage in order not to bind unspecifically to cell membranes before the PrGag-complex has been delivered to the plasma membrane viral capsid assembly sites (Alfadhli et al., JMB 2011, 410, ). The binding affinity of MyrMA to RNA has been analyzed in an experiment as shown below. In the experiment to the left, binding of fluorescently labeled Sel25 RNA is studied. In the experiment to the right, the experiment has been extended to also include binding of the molecules PSC6 och PIP2C8. Measurements were conducted using 5 nm FITC-labelled Sel25 RNA in buffers at the indicated ph value. Assays were performed with 5 nmfitc-sel25 and 1 μm MyrMA plus increasing concentrations of untagged Sel25, di-c6 PS (PSC6), or PIP2C8. Measurements were obtained in triplicate, and dissociation curves were fitted to exponential decay best-fit curves. a) Which method has been used for these experiments? b) What is FITC, do you think? c) Explain how the experiments have been designed and why the signals increase/decrease. d) Can the results to the right be used to determine affinities for the various ligands? Describe how! e) Are there situations where there is binding to MyrMA but no signal in the experiment to the right? Explain! Suggest a control experiment.

12 Question 5 (10p) In the experiment below, the complex between MyrMA and Sel15 (a shorter variant of Sel25) has been analysed. A confirmation of 1:1 binding stochiometry was obtained. Samples of 10 μm FITC-Sel15 RNA only or 10 μm FITC-Sel15 RNA plus 4-fold molar excess of MA were prepared in 25 mm sodium phosphate (ph 7.8) and 50 mm NaCl. Equilibrium experiments were carried out at 16 C using 12-mm cells and 2-channel centerpieces at 20,000 rpm, monitoring the absorbance of the free and bound FITC-labeled RNA at 490 nm. a) Which method has been used? b) Describe briefly how this method works and how results are obtained. c) Which alternative method could have been used to obtained similar results? Why, do you think, did the researchers prefer to use the method above? d) The experiment was detected by analysing absorbance at 490 nm. Discuss why this was done and how this may have simplified the interpretation of the results. Question 6 (5p) Using yet another biomeasurement technology, the following results were obtained: A surface representation of the MA structure is shown. Residues that exhibited significant chemical shift changes (Δδ-HN 0.15 ppm) on Sel15 RNA binding are colored red. a) Which method was used? b) Describe the approach by drawing a figure outline/sketch of the appearance of the most important experiment in the study (name of experiment? don t forget axis labels) and describe how it was used to obtain the results above. c) What other type of information is required to interpret the experimental data you described in b)?

13 Question 7 (12p). The scientists would now like to proceed to measure the effect on secondary structure and/or stability of the protein both in the free state and in the membrane, in the presence and absence of RNA. Suggest appropriate strategies and methods for this! Think about the following: - Two methods should be used, motivate your choice. - What should be measured? Using what type of equipment? - Describe the kind of data that is produced by these measurements. Draw sketches. - Briefly describe how the data is evaluated. Question 8 (8p) Six years have passed, and a protein drug against HIV has now been developed based on the MA protein and its interactions. As a newly examined Master s Student of Chemical Biology, you have been recruited into a group of researchers and developers assigned to take this protein drug to the product stage. Your new Boss, who has a background in molecular medicine, is now asking for your advice. Which problems do you foresee? Choose TWO problem areas and discuss how different biomeasurement technologies can be used in order to guarantee that the product can be safely used by patients. Good luck! Maria