Introduktion till laboration Biokemi 1

Transkript

1 Introduktion till laboration Biokemi 1 Annica Blissing IFM Biochemistry

2 Upplägg Laborationen sträcker sig över flera tillfällen Isolering, gelfiltrering, absorbansmätning och påvisande av sulfat Provberedning, SDS-PAGE, pipettkalibrering, gelinfärgning Dataanalys och diskussion kring resultat Rapport 2

3 Förberedelser Tillfälle 1 Väl införstådd med teorin Plan för utförandet Tillfälle 2 Väl införstådd med teorin Plan för utförandet Beräknat provvolym till SDS-PAGE Alltså VAD och VARFÖR Vi hjälper er med HUR! Tillfälle 3 analys och diskussion All insamlad data Repeterat teorin inför diskussion 3

4 Teori inför laborationen 4

5 Separationstekniker Inom biokemi vill man i princip alltid separera komponenter i en lösning. Isolera och rena hemoglobin Olika separationskriterier centrifugering och utsaltning gelfiltrering Kontrollera renhet och bestämma molekylvikt med SDS-PAGE 5

6 Hemoglobin 4 subenheter kvartärstruktur 6

7 Hemoglobin 7

8 Erytrocyter Semipermeabelt membran Erytrocyt Porer och kanaler ClNa+ K+ K+ Na+ H2O joner Na+ Na+ Cl- Na+ Cl- K+ K+ K+ Diffusion ClSamma osmotiska tryck i och utanför cellen 8

9 Osmos Diffusion från högre koncentration till lägre koncentration, tills koncentrationsgradienten är utjämnad. 9

10 Lysering H2O H2O H2O H2O [NaCl] Isoton lösning 0.9% NaCl H2O H2O [NaCl] H2O H2O H2O H2O Hypoton lösning < 0.9% NaCl H2O H2O Hyperton lösning > 0.9% NaCl H2O H2O H2O 10

11 Utsaltning Proteiner har laddningar på ytan Olika sammansättning av laddningar på ytan löslighet neutralisera laddningarna faller ut vid olika saltkoncentrationer löslighet tillsätt motladdningar tills proteinets laddningar neutraliserats Separation med avseende på löslighet (NH4)2SO4 11

12 Gelfiltrering Separation med avseende på storlek och form. Tvärbunden glukospolymerer Små molekyler går in i gelkornen Större molekyler får inte plats vandrar runt gelkornen lång vandringssträcka kortare vandringssträcka Size exclusion chromatography 12

13 13

14 Kromatogram Absorbans 280 nm baslinjeseparation Voidvolym Volym (ml) fraktioner 14

15 Gelfiltrering Separation med avseende på storlek och form. Avlånga och utsträckta molekyler uppför sig som att de hade högre molekylvikt Calmodulin PDB molecule of the month Aug

16 Gelfiltrering Avlånga och utsträckta molekyler uppför sig som att de vore större Hydrodynamisk radie svårare att ta sig in i gelkornen än globulära partiklar separation trots samma molekylvikt! globulär 16

17 Gelfiltrering Omvänd sil störst går först Separation med avseende på storlek och form. separationskriterier 17

18 Gelelektrofores Laddad partikel rör sig mot pol i elektriskt fält jmf elektrolys polyakrylamidgel Proteiner har laddningar på ytan tredimensionellt nätverk 18

19 Polyakrylamidgelelektrofores Tredimensionellt nätverk Bestämd porstorlek bisakrylamid Separation med avseende på storlek Stora molekyler retarderas Små molekyler passerar lättare Minst går först 19

20 Polyakrylamidgelelektrofores 20

21 Polyakrylamidgelelektrofores Proteinbanden färgas med coomassie visualisera 21

22 Polyakrylamidgelelektrofores MEN formen påverkar migrationen! Kan ha samma form men olika laddningar på ytan Nativ struktur påverkar migrationen form laddning Lösning: denaturera! 22

23 SDS-PAGE Sodium dodecyl sulphate polyacrylamide gel electrophoresis disulfidbryggor och primärstruktur intakta bryter icke-kovalenta bindningar Sekundär Tertiär Kvartär β-mercaptoetanol denaturering SDS binder till proteiner negativ nettoladdning Alla peptidkedjor får samma form och laddning 23

24 SDS-PAGE Alla peptidkedjor samma laddning och form Samma elektroforetiska mobilitet Separation endast m a p storlek Molekylviktsbestämning Renhetsbedömning 24

25 SDS-PAGE Molekylviktsbestämning Referensproteiner med kända molekylvikter Mät vandringslängder Log-diagram Log molekylvikt Vandringslängd (mm) Exempelrapport på kurshemsidan! 25

26 Log-diagram SDS-PAGE 5.5 f(x) = -0.02x Logaritmerad molekylvikt 5.1 Använd för att räkna ut molekylvikten vandringslängd (mm) 26

27 Log-diagram SDS-PAGE 5.5 f(x) = -0.02x Logaritmerad molekylvikt vandringslängd (mm) 27

28 Viktigt! Molekylvikten säger INGENTING om provets renhet! Hur avgör man renheten? 28

29 SDS-PAGE Renhetsbedömning Ett band = en molekylvikt Ofta en sorts protein Ett band = rent protein 29

30 Renhetsbedömning MEN vissa proteiner kan uppvisa fler än ett band Kom ihåg: Hb har 4 subenheter Så är inte alltid fallet! Hb:s subenheter väger lika ~ g/mol endast ett band på gelen! 30

31 Jämförelse Gelfiltrering PAGE Calmodulin PDB molecule of the month Aug momid=44 Nativt protein SDS-PAGE Nativt protein storlek storlek form form Denaturerat protein storlek laddning 31

32 Jämförelse Absorbans 280 nm Använda gelfiltrering för molekylviktsbestämning? Kända referensproteiner på samma sätt som SDS-PAGE Referensproteiner med samma form! Volym (ml) 32

33 Isolering och rening av hemoglobin 33

34 Laborationer på Biokemi 1 Kom i tid Kom förberedd Labbar börjar med genomgång och kort förhör Förväntas ha koll på läget Närvaro förutsättning för att få labba! Obligatorisk närvaro Hela labpasset Meddela förhinder till handledare i god tid Meddela oss direkt om något händer! Rapportera närvaro efter avslutat labtillfälle Gör vid varje labtillfälle! 34

35 1.5 ml helblod 500 g, 15 min Supernatanten kastas Tvätt 0.9% NaCl 500 g, 10 min Supernatanten kastas Hemolys H2O Utsaltning 385mg/ml (NH4)2SO g, 15 min Supernatanten kastas Lös pellet, 3 delar H2O 1000 g, 10 min Pelleten kastas 35

36 1.5 ml helblod 500 g, 15 min pellet Tvätt 0.9% NaCl 500 g, 10 min H2O Supernatanten kastas Supernatanten kastas Hemolys H2O Utsaltning 385mg/ml (NH4)2SO g, 15 min Supernatanten kastas Lös pellet, 3 delar H2O 1000 g, 10 min Pelleten kastas 36

37 1.5 ml helblod 500 g, 15 min Supernatanten kastas Tvätt 0.9% NaCl 500 g, 10 min Supernatanten kastas Hemolys H2O Utsaltning 385mg/ml (NH4)2SO4 H2O 1000 g, 15 min Supernatanten kastas Lös pellet, 3 delar H2O 1000 g, 10 min Pelleten kastas 37

38 0.5 ml Viktigt att gelytan är rak! Gelen får aldrig torrläggas! Gelfiltrering för att separera (NH4)2SO4 från Hb Gelen ekvilibrerad jämviktad anpassade buffertförhållanden från utfällningen Ekvilibreringslösning genom kolonnen 38

39 Absorbansmätning Lambert-Beers lag A=ε c l ε = M-1 cm-1 I I0 l = 1 cm c = koncentrationen i molar ε = molära absorptiviteten l Om A > 1 måste provet spädas 39

40 40

41 Påvisa sulfatjoner Giftigt! En droppe Ba(NO3)2 OBS! Inte till toppfraktionen! anvisad plats skyddsutrustning Högst koncentration Hb till SDS-PAGE 41

42 Kromatogram konstruerat av Forskarskolans elever

43 hemoglobin sulfatjoner Separation! 43

44 Utbyte 0.5 ml supernatant absorbansvärden koncentration massa eller substansmängd hemoglobin 44

45 Rapporten 45

46 46

47 Rapporten Utförlig och komplett rapport! Inledning Syfte och utförlig teori Resultat Redovisas tydligt Rådata, beräkningar, figurer/bilder, tabeller... Utförande Beskriv tillvägagångssätt Passiv form! Håll isär utförande och teori! Riskanalys Diskussion Diskutera resultaten Felkällor och hur de har påverkat resultatet Jämförelse GF + SDS-PAGE Akrylamid 47

48 Rapporten Examination 5 arbetsdagar En rapport för alla tillfällen Tänk på helheten! Elektronisk inlämning 3 rättningar Enligt riktlinjer Gäller även returer + punkterna i handledningen Copy paste oacceptabelt Se baksidan på försättsbladet Track changes aktiverat Fullständig! Saknas något retur right-first-time 48

49 Tips inför rapporten Skriv inledning och utförande så snart som möjligt Se det som förberedelse Skriv resultat och diskussion så snart som möjligt Se även Redovisning i kompendiet! Checka av att allt är med Passa på att fråga oss på schemalagd tid Vi svarar gärna! Utanför schemalagd tid jobbar vi med annat Säkrast: Använd allt tillgängligt material! Föreläsningsanteckningar Kursboken Labhandledningen 49

50 Förberedelser Tillfälle 1 gelfiltrering Väl införstådd med teorin Plan för utförandet Tillfälle 2 SDS-PAGE Väl införstådd med teorin Plan för utförandet Beräknat volym Hb Alltså VAD och VARFÖR Vi hjälper er med HUR! Tillfälle 3 analys och diskussion All insamlad data Funderat på förväntad molekylvikt 50

51 Vi ses på lab! Annica Blissing Amelie Wallenhammar Mikaela Eliasson 51