Analysera gifter, droger och andra ämnen med HPLC och GC. Niklas Dahrén

Transkript

1 Analysera gifter, droger och andra ämnen med HPLC och GC Niklas Dahrén

2 Vad står förkortningarna GC och HPLC för? GC= gas chromatography eller på svenska gaskromatografi. HPLC= high performance liquid chromatography eller på svenska högupplösande vätskekromatografi. HPLC är en avancerad form av vätskekromatografi. Det finns även andra enklare och mer begränsade former av vätskekromatografi, t.ex. papperskromatografi, tunnskiktskromatografi, jonbyteskromatografi och gelfiltrering. Namnet kromatografi kommer av det grekiska ordet chroma som betyder färg. I början användes kromatografiska metoder endast för färgade ämnen men nu används dessa även Cll ofärgade ämnen så namnet är därför lite missvisande.

3 Vad används GC och HPLC till? 1. Separera (rena) olika ämnen som finns i eb prov: Vi kanske har ee prov som innehåller ee stort antal olika ämnen, men vi är enbart intresserade av ee av dessa ämnen. Vi kan då använda GC eller HPLC för ae separera ämnena från varandra och därmed isolera det ämne vi är ute eker. 2. Undersöka vilka okända ämnen som finns i eb prov: Vi kan idencfiera okända ämnen (t.ex. giker, droger, dopingpreparat, miljögiker eller läkemedel) med dessa metoder. Om vi dessutom kopplar vår GC eller HPLC Cll en masspektrometer får vi ee mycket krakfullt verktyg för ae idencfiera okända ämnen. 3. Bestämma koncentraionen av olika ämnen som finns i eb prov: GC och HPLC kan också användas kvanctacvt för ae mäta koncentraconen av de ämnen som finns i ee prov. 4. Renhetstester: Vi kan undersöka om ee prov är förorenat med andra ämnen som inte bör finnas där (t.ex. renhetstester av läkemedel eller livsmedel).

4 3 saker är gemensamt för både GC och HPLC Prov: I både GC och HPLC CllsäEs ee prov innehållande olika ämnen som ska analyseras. Mobil fas: I både GC och HPLC finns en s.k. mobil fas (rörlig fas). Den mobila fasen i GC består av en gas (helium, kvävgas eller vätgas) medan den i HPLC består av en vätska (en blandning av olika ämnen). SyKet med den mobila fasen är ae transportera provet genom gas- eller vätskekromatografen, alltså genom den maskin som ska uqöra själva analysen. StaIonär fas: I både GC och HPLC finns en kolonn (ee ihåligt rör) som på insidan är beklädd med en staconär fas (scllastående fas) som består av olika molekyler. Molekylernas uppgik i den staconära fasen är ae binda Cll de olika ämnena i provet så ae dessa ämnen bromsas upp inuc kolonnen. Vissa ämnen kan binda mycket starkare Cll molekylerna i den staconära fasen och tar därför längre Cd på sig genom kolonnen och det är grunden Cll hela analysen i GC och HPLC.

5 En högupplösande vätskekromatograf (HPLC)

6 Principen bakom HPLC En pump som pumpar den mobila fasen och provet genom hela systemet Pump Detektorn gör ee kromatogram där varje topp motsvarar ee ämne i provet Mobil fas Behållare med den mobila fasen (vätska) Här CllsäEs provet Injektor Detektorn känner av när ee ämne passerar och registrerar retenconscden och intensiteten Detektor Kolonn med staconär fas I kolonnen separeras ämnena i provet från varandra ekersom olika ämnen binder olika läe Cll den staconära fasen och kommer därför ut vid olika Cdpunkter

7 Separationen i HPLC sker utifrån polaritet Polära och opolära ämnen: Alla ämnen kan delas in i polära ämnen (dipoler) och opolära ämnen (ej dipoler). Det är dock en scgande skala där vissa polära ämnen har ganska hög polaritet medan andra ämnen har mycket hög polaritet etc. Polära och opolära ämnen skapar olika typer av intermolekylära bindningar: Polära ämnen kan dels bilda vätebindningar eller vanliga dipol-dipolbindningar och dels van der Waalsbindningar (alla ämnen kan bilda van der Waalsbindningar) medan opolära ämnen endast kan ge upphov Cll van der Waalsbindningar. Polär eller opolär staionär fas: Den staconära fasen i kolonnen är ancngen polär eller opolär (väljs bl.a. beroende på vilka ämnen som ska analyseras, dock vanligast med opolära kolonner) och det kommer påverka separaconen av ämnena i provet. Polär eller opolär mobil fas: Om kolonnen är opolär väljs en mobil fas som är mer polär än den staconära fasen och om kolonnen är polär väljs en mobil fas som är mer opolär. SeparaIon uifrån polaritet: Ämnen som är polära kommer i högre grad välja den fas som är mest polär. Om den staconära fasen i kolonnen är polärare än den mobila fasen så kommer dessa ämnen vilja binda Cll den staconära fasen i högre grad (och tvärtom).

8 Separationen i HPLC sker utifrån polaritet Om den staionära fasen i kolonnen är polär (består av polära molekyler) samcdigt som den mobila fasen är mer opolär kommer de polära ämnena i provet bromsas upp mest inuc kolonnen ekersom dessa kan binda med starka bindningar (vätebindningar eller dipol-dipolbindningar) Cll den staconära polära fasen. De opolära ämnena kommer åka snabbast igenom kolonnen ekersom dessa ämnen inte kan binda Cll den staconära fasen lika bra. Opolär mobil fas Polärt ämne som binder Cll den polära staconära fasen Polär Polär Polär Opolärt ämne som inte binder så bra Cll den polära staconära fasen Opolär Opolär Opolär De opoläraste ämnena åker ut först Polär staconär fas inuc kolonnen

9 HPLC-analyser kan utföras på 2 olika sätt 1. Normal-fas-kromatografi (polär kolonn): Polära ämnen binder med starka vätebindningar eller dipol-dipolbindningar Cll den polära staconära fasen och bromsas därför mest i kolonnen. Opolära ämnen binder inte lika bra Cll den staconära fasen och åker därför ut först genom kolonnen. 2. Omvänd-fas-kromatografi (opolär kolonn): Opolära ämnen består oka av kolvätekedjor och kan därför skapa relacvt starka van der Waalsbindningar Cll den opolära staconära fasen som också består av kolvätekedjor. SamCdigt trivs de polära ämnen bäere i den mobila fasen ekersom de kan binda Cll den med starka vätebindningar eller dipol-dipolbindningar. DeEa sammantaget leder Cll ae de polära ämnena åker ut först genom kolonnen. Normal-fas-kromatografi (straight-phase) Opolär mobil fas (t.ex. en blandning av hexan och kloroform) Polär staconär fas (OH-grupper) Omvänd-fas-kromatografi (reversed phase) Polär mobil fas (t.ex. en blandning av vaben och metanol) Opolär staconär fas (kolväten, t.ex. C18) De opoläraste ämnena åker ut först De poläraste ämnena åker ut först Obs. De mobila faserna består av blandningar av olika ämnen med olika polaritet. Vi vill nämligen inte ha en mobil fas som 100 % polär eller 100 % opolär ekersom alla ämnen Cll slut ska kunna ta sig igenom kolonnen.

10 Separationen i HPLC sker utifrån polaritet Omvänd-fas-kromatografi: Normal-fas-kromatografi:

11 Exempel på hur en HPLC-analys fungerar Opolär staconär fas Polär mobil fas Opolär staconär fas Ämne RetenIonsId (min) 1,5 3,0 6,5 9,5

12 De 4 ämnena får olika retentionstid beroende på deras polaritet Ämne RetenIonsId (min) 1,5 Polaritet 3,0 6,5 9,5 RetenIonsIden: Den Cd det tar för ämnet ae passera igenom kolonnen och fram Cll detektorn. RetenIonsIden är specifik för varje ämne och vi kan därför använda retenconscden för ae idencfiera de ämnen vi har i vårt prov.

13 Intensiteten Ett kromatogram visar intensiteten och retentionstiden för de 4 ämnena Ämne 1 Ämne 2 Ämne 3 Ämne 4 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5 5 5,5 6 6,5 7 7,5 8 8,5 9 9,5 10 RetenIons- Iden RetenIonsIden är specifik för varje ämne och visar därför vilket ämnet är (kvalitacv analys). Toppens area avslöjar däremot hur stor koncentracon vi har av ämnet (kvanctacv analys).

14 Exempel på ett riktigt kromatogram Bildkälla: "Hplc-perfume-chromatogram" by Lukke - Own work. Licensed under CC BY-SA 3.0 via Commons - heps://commons.wikimedia.org/wiki/file:hplcperfume-chromatogram.png#/media/file:hplc-perfume-chromatogram.png

15 Här CllsäEs provet Injektor Principen bakom GC Ugnen förgasar ämnena i provet Detektorn gör ee kromatogram där varje topp motsvarar ee ämne i provet Mobil fas Gasbehållare med den mobila fasen (gas) Ugn Kolonn med staconär fas Detektorn känner av när ee ämne passerar och registrerar retenconscden och intensiteten Detektor I kolonnen separeras ämnena i provet från varandra ekersom olika ämnen binder olika läe Cll den staconära fasen och kommer därför ut vid olika Cdpunkter

16 En gaskromatograf (GC)

17 Separationen i GC skiljer sig åt jämfört med separationen i HPLC Den mobila fasen i GC har ingen direkt interakion med ämnena i provet (inga bindningar skapas) utan fungerar bara som ee transportmedel ( knuffar på våra ämnen så ae de rör sig framåt). Därför används inte begreppen polär eller opolär när vi pratar om den mobila fasen. I GC finns en ugn som höjer temperaturen så ae våra ämnen i provet förgasas. Ämnena måste vara i gasform för ae kunna transporteras från start Cll mål i en gaskromatograf. Desto högre temperatur desto snabbare kommer ämnena transporteras genom kolonnen ekersom ämnena kommer ha svårare ae binda Cll den staconära fasen vid en högre temperatur. Det är alltså gasen + temperaturen som Cllsammans får ämnena ae transporteras genom kolonnen. Kokpunkt och polaritet påverkar separaionen och retenionsiden: När ämnen kommer in i kolonnen kommer vissa ämnen binda starkare än andra ämnen Cll kolonnen. I en opolär kolonn är det ämnenas kokpunkt som indirekt avgör hur läe de binder Cll kolonnen. I en polär kolonn är det kokpunkten Cllsammans med ämnenas polaritet som har betydelse.

18 Separationen i GC sker utifrån kokpunkt om det är en opolär kolonn Om kolonnen är opolär är det enbart van der Waalsbindningar (LondonkraKer) som kan uppstå mellan ämnena i provet och den staconära fasen (inga vätebindningar eller dipol-dipolbindningar är möjliga). Stora molekyler (oavsee polaritet) är dels tyngre än mindre molekyler och de kan dessutom skapa starkare van der Waalsbindningar (LondonkraKer) Cll kolonnen. Stora molekyler är därför okast mindre flykcga och har i regel högre kokpunkt jämfört med mindre molekyler. Ämnenas kokpunkt är därför relaterat Cll retenconscden i en opolär kolonn. Opolära kolonner används framförallt om man i förväg vet om ae provet innehåller mest opolära ämnen. Mobil fas Ämne 3 De ämnen som har lägst kokpunkt åker ut först Ämne 2 Ämne 1 Opolär staconär fas (kolväten, t.ex. C18)

19 Separationen i GC sker utifrån kokpunkt och polaritet om det är en polär kolonn Även om kolonnen är polär så har forzarande ämnenas kokpunkt betydelse (t.ex. så kan van der Waalsbindningar uppstå mellan alla olika ämnen), men skillnaden nu är ae polära ämnen i provet kan bilda starka vätebindningar och/eller vanliga dipol-dipolbindningar Cll den staconära fasen vilket också påverkar retenconscden. De ämne som stannar kvar längst i kolonnen (längst retenconscd) är därför de ämnen som består av stora och polära molekyler medan ämnen som består av små och opolära molekyler kommer åka ut först. Opolära kolonner används framförallt om man i förväg vet om ae provet innehåller mest polära ämnen. Här är det svårt ae säga vilket ämne som får längst retenconscd. EE litet ämne med möjlighet Cll många vätebindningar kan få längre retenconscd jämfört med större opolärare ämnen. Mobil fas Ämne 3: Liten och polär Ämne 2: Stor och opolär Ämne 4: Liten och opolär De ämnen som har lägst kokpunkt/polaritet åker ut först Ämne 1: Stor och polär Polär staconär fas (OH-grupper)

20 Vad är de viktigaste skillnaderna mellan GC och HPLC? Olika mobila faser: I gaskromatografi används en gas som mobil fas (helium, kvävgas eller vätgas) medan en vätska (en blandning av olika ämnen) används vid HPLC. HPLC kan användas för fler ämnen: GC kan enbart separera ämnen som är flykcga (kan övergå i gasform relacvt läe) och som är värmetåliga. Det är enbart ämnen som har en lägre kokpunkt än 350 grader som kan analyseras med GC, vilket motsvarar ca % av alla kända ämnen. HPLC kan däremot användas även för icke flykcga ämnen och för ämnen som är värmekänsliga och har därför ee större användningsområde (t.ex. används HPLC för kolhydrater, feeer och proteiner och har därför stor betydelse inom biokemi, medicin etc.). Fördelen med GC framför HPLC är framförallt ae det är en snabbare och lite enklare metod ae genomföra.

21 Vi kan förbättra separationen i kolonnen genom att ändra olika faktorer Ibland blir upplösningen inte Illräckligt bra. I kromatogrammet kan det det vara så ae topparna från 2 olika ämnen sammanfaller vilket innebär ae det är svårt ae veta vilken topp som är från vilket ämne och det är svårt ae göra en koncentraconsbestämning av ämnena. Åtgärder för ab förbäbra separaionen och få en bäbre upplösning i kromatogrammet: 1. Använda en kolonn med en annan storlek: I en längre och/eller smalare kolonn kommer de olika ämnena i provet binda fler gånger Cll den staconära fasen och därmed separeras från varandra i högre utsträckning. 2. Sänka hasigheten av den mobila fasen: Om vi sänker den mobila fasens hascghet så kommer ämnena i provet ha längre Cd på sig inuc kolonnen och de kommer hinna binda i större utsträckning Cll den staconära fasen. Det leder Cll en bäere separacon. 3. Ändra kolonnens polaritet: Om vi får en dålig separacon på en opolär kolonn så kan vi testa med ae byta ut den mot en polär kolonn (eller tvärtom). 4. Ändra den mobila fasens polaritet (HPLC): I HPLC kan vi öka eller minska polariteten av den mobila fasen genom ae påverka sammansäeningen av de ämnen som ingår. 5. Ändra temperaturen (GC): I GC kan vi sänka temperaturen vilket innebär ae ämnena kommer ha läeare ae binda Cll den staconära fasen (övergår inte i gasform lika läe). Det leder Cll totalt säe fler interakconer mellan ämnena och den staconära fasen och därmed en bäere separacon.

22 Exempel: Analys av droger i ett urinprov med hjälp av HPLC De kemiska forensikerna på NaConellt forensiskt centrum (NFC) i Linköping får Cll uppgik ae analysera ee urinprov från en person som misstänks ha intagit någon form av drog. Forensikerna väljer ab analysera provet med hjälp av HPLC. Bildkälla: By James Heilman, MD (Own work) [CC BY-SA 3.0 (hep:// creacvecommons.org/licenses/by-sa/3.0)], via Wikimedia Commons. hep://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/2/29/pyuria2011.jpg.

23 Kända retentionstider för några utvalda ämnen Utseende: Namn: RetenIonsId (min) Urinämne 2,5 Kokain 6,0 Anabola steroider 8,2 Amfetamin 8,9 Innan de uzör analysen tar de fram en tabell med kända retenconscder för de ämnen de misstänker kan finnas i urinprovet (obs. påhieade retenconscder!). Genom ae jämföra de erhållna retenconscderna med de kända så kan de lista ut vilka okända ämnen som finns i urinprovet.

24 Vilket eller vilka ämnen finns i urinprovet? Ämnen som passerar detektorn: RetenIonsId (min): 2,5 IdenIfiering av ämnena: Urinämne 6,0 Kokain Slutsats: Urinprovet innehåller urinämne och kokain.

25 Intensiteten Kromatogram av urinprovet Urinämne (urea) Kokain 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5 5 5,5 6 6,5 7 7,5 8 8,5 9 9,5 10 RetenIonsIden

26 Uppgift: Ett prov med okända ämnen analyseras med hjälp av HPLC (polär kolonn). Tre retentionstider erhålls; 2,5, 7,7 och 12,3. Kemisterna identifierar nedanstående tre ämnen i provet. Men vilken retentionstid tillhör vilket ämne? Butan Glycerol Butanol RetenIonsId 2,5: Opolärt ämne, kan ej bilda vätebindningar eller dipol-dipolbindningar med den polära kolonnen. Åker därför snabbast genom kolonnen. RetenIonsId 12,3: Polärt ämne, har 3 OH-grupper och kan därför bilda många vätebindningar med den polära kolonnen. Åker därför långsammast genom kolonnen. RetenIonsId 7,7: Polärt ämne, har 1 OH-grupp och kan därför bilda vätebindningar med den polära kolonnen. Kan dock inte bilda lika många vätebindningar som glycerol. Åker därför igenom kolonnen näst snabbast.

27 Uppgift: Ett prov som innehåller cyklohexan (80,7 C), butanon (79,64 C) och etanol (78,37 C) analyseras i en GC som har en polär kolonn. Vilket ämne får längst retentionstid? Cyklohexan Butanon Etanol Svar: I en GC med en polär kolonn är det kombinaconen av kokpunkt och polaritet som avgör retenconscden. Alla 3 ämnen har likartade kokpunkter vilket innebär ae det är deras polaritet som kommer vara avgörande i det här fallet. Cyklohexan är ee opolärt ämne som ej kan binda Cll kolonnen med vätebindningar eller dipol-dipolbindningar. Cyklohexan kommer därför transporteras snabbast genom kolonnen och har därför kortast retenconscd. Butanon är ee polärt ämne (dipol) och kan binda med dipol-dipolbindningar Cll kolonnen. Butanon kan dock ej skapa vätebindningar och kommer därför ha näst kortast retenconscd. Etanol innehåller en OH-grupp och kan därför binda med starka vätebindningar Cll den polära kolonnen. Etanol kommer därför bromsas upp mest inuc kolonnen och får den längsta retenconscden.

28 För den bästa kvalitativa analysen krävs dock en masspektrometer som detektor Många prover är komplexa och innehåller eb stort antal ämnen med likartade retenconscder. Dessa är därför svåra ae idencfiera med enbart GC eller HPLC kopplad Cll en vanlig detektor. Om vi däremot kopplar vår GC eller HPLC Cll en detektor som heter masspektrometer (MS) så kommer vi få ee mycket krakfullt verktyg. Dessa analysmetoder kallas för GC-MS resp. HPLC-MS. Med hjälp av en masspektrometer kan massan av de olika ämnena i provet bestämmas. Masspektrometern kan även lista ut vilka delar som finns i de olika ämnenas molekyler ekersom molekylerna slås sönder i mindre beståndsdelar och sedan vägs varje beståndsdel. Varje beståndsdel i molekylen kan då idencfieras och vi kan göra en strukturbestämning av hela molekylen. Masspektrometern skapar på deea säe ee kemiskt fingeravtryck för varje ämne. Därmed kan vi idencfiera helt nya ämnen (t.ex. helt nya droger).

29 Se gärna fler filmer av Niklas Dahrén: hbp:// hbp://