Namn: student x & student y Kurs: FAGBH0 Utförd:

Transkript

1 Laboration: Isolering av kinin Namn: student x & student y Kurs: FAGBH0 Utförd: Handledare: Patrik Holm 1

2 Innehållsförteckning Innehållsförteckning... 2 Sammanfattning... 3 Inledning... 3 Utförande... 4 Material... 4 Metod... 4 Resultat... 6 Diskussion:... 8 Referenser

3 Sammanfattning Syftet med laborationen var att extrahera de fyra alkaloiderna kinin, kinidin, cinkonin och cinkonidin från Rubiaceae Cinchona-bark genom Soxhletextraktion och sedan renas ytterligare genom fastfasextraktion med C-18 kolonn i plastspruta. TLC användes för att utröna renhet under tre steg i extraktionsprocess och upparbetning. Utbytet blev 1,9 %. TLC visade separation av de fyra alkaloiderna i alla tre proven, vilka identifierades mot TLC med referenslösning. Resultat av TLC blev inte som förväntat eftersom de fyra alkaloiderna uppvisade separation redan efter första extraktionen och förändrade sig inte nämnvärt under de olika reningsstegen. Inledning Alkaloider är en grupp cykliska organiska ämnen som innehåller kväve och har ofta basiska egenskaper med begränsad distribution i levande organismer men återfinns i växtriket. De flesta alkaloider har farmakologiska effekter och används både till medicinska preparat och inom den illegala narkotikahandeln. Exempel på de båda är morfin respektive kokain. Bark från träd som tillhör Rubiaceae Cinchona innehåller ett 25-tal alkaloider. Den viktigaste alkaloiden är kinin men även dess stereoisomer kinidin. Det finns också två relaterade stereoisomerer till, cinkonin och cinkonidin, som inte används medicinskt (se fig. 1). Handelsnamnet är kinabark och har använts i århundraden som malariamedel. Både kinin och kinidin är aktiva mot malaria men kinidin används mest idag som profylax mot allvarliga hjärtrytmrubbningar. 1 I Sverige finns endast kinin som ingående aktiv substans i registrerat läkemedel. 3 H 2 C OH N R = OCH 3 : Kinin och Kinidin R R = H: Cinkonin och Cinkonidin N Fig. 1. Strukturformel för de vanligaste kinaalkaloiderna Stora mängder kinin används också som smakämne i bittra läskedrycker, t.ex. tonic water. 1 3

4 I den här laborationen skulle kinin isoleras ur kinabark. Renheten skulle testas med TLC vid olika stadier i extraktionskedjan och upparbetning. Thin layer chromatography är en separationsteknik, här används den för att utröna renhet. Stationära fasen består av ett tunt lager silika bestruket på plattor av aluminiumfolie. Till silikan är oftast ett fluorescerande ämne tillsatt för att man enkelt ska kunna se de olika faserna i UV-ljus. En liten droppe prov appliceras på plattan ungefär en cm från basen. Plattan doppas sedan i ett lämpligt lösningsmedel varvid kapillärkrafter kommer att dra med sig lösningsmedel och provet uppåt. Innehåller provet olika komponenter kommer det att vandra olika fort på grund av skillnader i polaritet. Rf-värde (retentionsfaktor) kan sedan beräknas genom att dividera sträckan som provet vandrar med totala sträckan som lösningsmedlet vandrar. Värdena beror sedan av vilket lösningsmedel som använts och vilken typ av TLC-platta - inte en fysisk konstant.2 Utförande Material Kinabark Diklormetan Natriumhydroxidlösn. (2 %) Svavelsyra (0,2 M) Svavelsyra (0,01 M) CaO Metanol Etanol ca 15 g irriterande, giftig frätande frätande frätande 1,9 g brandfarlig, giftig brandfarlig Metod Förberedelser Kalken släcktes med 30 ml vatten och 15 ml 2 % NaOH tillsattes. Barken rördes sedan ner i mixen och blandades väl. Över natt torkades allt i ett hundragradigt värmeskåp. Soxhletextraktion Den torkade kakan av kinabarkmixen maldes i en mortel och överfördes till en extraktionshylsa. 200 ml diklormetan hälldes i rundkolven. Extraktionen avbröts efter 6 extraktioner. Ett par droppar sparades av extraktet för senare analys med TLC. 4

5 Fig. 2. Soxhletuppsättning 4 Upparbetning Diklormetanlösningen från föregående extraktion extraherades med 2x15 ml 0,2 M svavelsyra i en separationstratt (se fig. 3). Syralösningen hamnade överst. En filtrering utfördes för att få emulsionen att bryta samt bortrensning av partiklar och föroreningar. Kontroll skedde sedan med UV-ljus (366 nm) på de båda lösningarna. Om lösningen innehåller kinin ska den lysa med ett blålila sken. Diklormetanen lös fortfarande med ett blålila sken och en extraktion med ytterligare 15 ml utfördes. Syralösningen filtrerades därefter genom ett 0,45 μm sprutfilter. Ett par droppar sparades av extraktet för senare analys med TLC. Fig. 3. Separationstratt Fastfasextraktion En C-18 fastfaskolonn av plastsprutetyp med luertip-koppling (se fig. 4) förbereddes genom att montera på en kran på kopplingen. Kolonnen konditionerades därefter med 5 ml metanol, 5 ml avjoniserat vatten och slutligen 5 ml 0,01 M svavelsyra. Syraextraktet satsades i 5 ml portioner över kolonnen och eluerades sedan ut med 4 ml etanol i en förinvägd rundkolv. 5

6 Proceduren upprepades 4 ggr. Ett par droppar sparades för senare analys med TLC och resten rullindunstades. Fig. 4. Exempel på engångskolonner i plast 5 TLC utfördes i vannor med diklormetan:dietylamin 9:1 som elueringsmedel. TLC utfördes också på referensprover av; kinin, kinidin, cinkonin och cinkonidin. Resultat Invägd mängd kinabark: 15 g Extrakt kvar efter indunstning: 0,29 g Uträkning av utbytet visade att vi fick ut; 0,29g 100 1,9% som var en blandning av de fyra alkaloiderna kinin, kinidin, cinkonin och 15g cinkonidin. TLC visade: Fig. 5: Prov 1-3 i tur och ordning från vänster. 6

7 Fig. 6: TLC på referenslösningarna; gul = kinin, blå = kinidin, turkos = cinkonin och rosa = cinkonidin. Rf-värden: Tabell 1: Rf-värden på TLC-proverna. Färgkod: Prov 1 Prov 2 Prov 3 Ref. Turkos 0,696 0,75 0,73 0,56 Blå 0,598 0,63 0,61 0,51 Rosa 0,52 0,55 0,54 0,41 Gul 0,37 0,42 0,40 0,26 TLC efter soxhletextraktionen Prov 1 sparades efter soxhletextraktionen. Redan här separeras alla fyra alkaloiderna (se prov 1, fig. 5). Rf-värden se tabell 1. Ordningen framkom då vi utförde TLC på referenslösningar (se fig. 6). 7

8 TLC efter upparbetningen Efter upparbetning fick provet något högre Rf-värden (se prov 2 fig. 5 och tabell 1) annars var det ingen skillnad. TLC efter fastfasextraktionen Efter fastfasextraktionen var Rf-värdena lite lägre igen (se prov 3 fig. 5 och tabell 1) annars ingen skillnad i jämförelse med de andra proven. Diskussion Det som var förvånande var att redan efter soxhletextraktionen visade TLC en separation av de olika alkaloiderna. Det förväntade resultatet var att första provet skulle visa en prick som vandrat, att provet efter upparbetningen skulle separera lite och fullständig separation först efter fastfasextraktionen. Referenser 1. Samuelsson G. (2004) Drugs of Natural Origin. Swedish Pharmaceutical Press, Sweden. 2. Harwood L.M. Moody C.J. Perry J.M. (1999) Experimental Organic Chemistry. Replika Press, India 3. Referens hämtad Referens hämtad Referens hämtad