Isolering och rening av proteinet tiopurinmetyltransferas

Transkript

1 Isolering och rening av proteinet tiopurinmetyltransferas Inledning och syfte Proteinet tiopurinmetyltransferas (TPMT) är ett humant enzym vars naturliga funktion ännu är okänd. Proteinet katalyserar överföring av metylgrupper till vissa typer av cytostatika (cellgifter), vilka därmed blir inaktiva. I denna laboration ska TPMT isoleras från ett lysat av E coli-celler med hjälp av affinitetskromatografi, varpå eluatet ska renas ytterligare genom jonbyteskromatografi. Därefter analyseras reningsprocessen med SDS-PAGE för att kontrollera det preparerade proteinets molekylvikt och renhet. Teori Affinitetskromatografi I denna laboration används affinitetskromatografi för att isolera TPMT från ett lysat av E coli-celler. Materialet i kolonnen är försett med immobiliserade nickeljoner. Nickel har egenskaper som gör att vissa atomer lätt binder till och bildar komplex med nickeljonen. Detta utnyttjas dels för att få nickeljonerna att binda in till kolonnmaterialet, och dels för att få protein att binda till de immobiliserade nickeljonerna. Med hjälp av gentektik har proteinet TPMT försetts med en så kallad His-tag. Denna består av 6 st histidiner som sitter i proteinets N-terminala del. Histidinernas sidokedjor innehåller kväve, vilket har hög affinitet för nickeljoner och lätt bildar komplex med dessa. Då proteinet passerar kolonnen kommer därmed His-taggen binda in till nickeljonerna på kolonnmaterialet varpå proteinet immobiliseras, medan övriga proteiner i lösningen passerar genom kolonnen utan att binda in. På så sätt kan TPMT isoleras ur lysatet och en högre renhetsgrad uppnås. För att eluera det inbundna proteinet från affinitetskolonnen tillförs en elueringsbuffert. Denna innehåller hög koncentration imidazol, vilket liknar sidokedjan hos aminosyran histidin. Imidazolen kommer därför att konkurrera med His-taggen om inbindningen till nickeljonerna på kolonnen. Eftersom halten imidazol är mycket högre än halten histidin som är inbundet till kolonnen så kommer det His-taggade proteinet att dissociera från kolonnen och eluera. Dialys Efter att proteinet eluerats från affinitetskolonnen måste koncentrationerna av imidazol och NaCl sänkas, eftersom dessa är alldeles för höga för jonbyteskromatografi. Ett buffertbyte kan då göras genom dialys, där eluatet dialyseras mot en buffert som har mycket lägre koncentrationer av imidazol och NaCl. Vid dialys används ett semipermeabelt membran som tillåter mindre molekyler att passera. 1

2 Eftersom TPMT är en mycket stor molekyl kommer denna att hållas kvar innanför membranet, medan mindre molekyler, så som imidazol och NaCl, kan diffundera fritt över membranet utmed sina respektive koncentrationsgradienter. Halten av dessa ämnen sänks därmed tills jämvikt uppstår mellan insidan och utsidan av membranet. Jonbyteskromatografi Efter att eluatet har dialyserats för att sänka koncentrationerna av imidazol och NaCl ska proteinet renas ytterligare med hjälp av jonbyteskromatografi. Vid jonbyteskromatografi utnyttjas den elektrostatiska interaktionen mellan olika laddningar. TPMT har en beräknad isoelektrisk punkt på ca 5.9, och är därmed negativt laddat vid ph 8. Eftersom kolonnmaterialet innehåller positiva laddningar (en så kallad anjonbytarkolonn) så kommer TPMT alltså att binda in till kolonnen på grund av den elektrostatiska interaktionen mellan proteinet och kolonnmaterialet. För att eluera det inbundna proteinet från jonbytarkolonnen måste den elektrostatiska interaktionen minskas. Detta kan göras antingen genom att sänka ph eller genom att öka salthalten. Eftersom TPMT är känsligt för förändringar i ph så används istället en förhöjd halt NaCl i elueringsbufferten. Detta medför en ökad halt kloridjoner som interagerar med den positivt laddade kolonnen och därmed konkurrerar med proteinet om att binda till kolonnmaterialet. Eftersom olika proteiner har olika laddningar på ytan, så krävs olika salthalt för att förmå dem att eluera från en jonbytarkolonn. TPMT interagerar dock mycket svagt med jonbytarkolonnen och 100 mm NaCl är tillräckligt för att eluera proteinet. Absorbansmätning För att avgöra hur mycket protein en lösning innehåller kan man använda sig av absorbansmätning. Ljus av en bestämd våglängd och känd intensitet skickas genom en kyvett fylld med provlösning. Om någon komponent i provlösningen absorberar ljus av just den våglängden så minskar intensiteten på ljuset som passerat genom provet. Detektorn jämför då intensiteten på det mottagna ljuset med intensiteten för det ljus som sänts ut mot provet, och räknar då ut absorbansen enligt A= log Io I (1) där A är absorbansen, I 0 är intensiteten för ljuset som sänds in i provet och I är intensiteten för ljuset som passerat provet. Absorbansen är proportionell mot koncentrationen av det absorberande ämnet enligt Lambert-Beers lag: A = c l ε (2) där c är koncentrationen i molar (M), l är längden på kyvetten (cm) och ε är den molära absorptiviteten (cm -1 M -1 ). För proteiner mäts oftast absorbansen vid 280 nm. Här absorberar aromatiska aminosyrors sidokedjor, framför allt tryptofan. Genom att använda Lambert-Beers lag kan koncentrationen protein i en lösning med känd absorbans beräknas. 2

3 SDS-PAGE SDS-PAGE står för sodiumdodecylsulfat polyakrylamidgelelektrofores. Som namnet antyder är det en elektrofores genom polyakrylamidgel, vilken består av polyakrylamid tvärbunden med bisakrylamid. Tvärbindningarna gör att en tredimensionell nätverksstruktur bildas. Ju högre grad av tvärbundenhet, desto mer finmaskigt nätverk. Genom att en spänning appliceras över gelen förmås laddade molekyler att vandra genom gelen mot fältets poler. Gelen kan på så sätt användas för att separera molekyler med avseende på storlek, där mindre molekyler lättare kan passera och därmed vandrar snabbare. Större molekyler däremot retarderas i varierande grad av gelen, och därmed uppnås en separation med avseende på storlek. Vid vanlig polyakrylamidgelektrofores (PAGE) så inverkar både proteinernas nativa form och nettoladdning. Eftersom globulära och mer kompakta proteiner lättare vandrar genom gelens nätverksstruktur, så kan de uppföra sig som om de hade en lägre molekylvikt än vad de i själva verket har. Omvänt så uppför sig avlånga och mer utsträckta proteiner som om de vore tyngre än vad de egentligen är, eftersom de i högre grad retarderas av gelen. Proteinernas nettoladdning beror av sammansättningen av polära och laddade grupper på deras yta. Eftersom proteiner har olika aminosyrasammansättning så har de även olika sammansättning av laddningar på ytan. De påverkas därmed också olika av ett elektriskt fält och vandrar olika snabbt mot polerna. Bestämning av molekylvikten blir därmed ytterst osäker eftersom så många olika faktorer spelar in vid PAGE. För att undvika att form och laddning påverkar separationen så använder man sig oftast av SDS som är en detergent. Denna bryter icke-kovalenta bindningar och förstör därmed sekundär-, tertiär- och eventuell kvartärstruktur hos proteinerna. För att även bryta kovalenta disulfidbindningar tillsätts β- mercaptoetanol. Alla peptidkedjor får då samma form och eftersom SDS har negativ laddning får protein- SDS-komplexen en negativ nettoladdning. Dock får de olika hög laddningstäthet i och med att mängden SDS som binder till peptidkedjan beror av dess längd (alltså dess storlek). De får alltså olika elektroforetisk mobilitet och kommer att separeras enbart med avseende på storlek. SDS-PAGE används i den här laborationen för att bestämma molekylvikten för preparerat TPMT och för att kontrollera renheten för det preparerade proteinet. Eftersom ett synligt proteinband på gelen (oftast) motsvarar ett protein, så kan vi enkelt avgöra renheten i proteinprover. Om endast ett band syns är provet alltså rent. För att avgöra om det är TPMT så bestäms också molekylvikten som proteinbandet motsvarar och jämför detta värde med den kända molekylvikten för proteinet. Material 5 ml-affinitetskolonn med immobiliserade Ni 2+ -joner 5 ml-jonbyteskolonn stativ med muffar och klämma E coli-lysat peristaltisk pump kyvetter automatpipetter och spetsar Buffertar och lösningar Inbindingsbuffert (5 mm imidazol, 250 mm NaCl) ph 8.0 Tvättbuffert (20 mm imidazol, 150 mmn NaCl) ph 8.0 Elueringsbuffert (500 mm imidazol, 150 mm NaCl) ph 8.0 Ekvilibreringsbuffert (0 mm imidazol, 15 mm NaCl) ph 8.0 Saltbuffert (0 mm imidazol, 100 mm NaCl) ph M NaCl laddningsbuffert elektroforesbuffert 3

4 Utförande Medan 30 ml lysat av E coli-celler tinades så ekvilibrerades affinietskolonnen med inbindningsbuffert på flödeshastigheten 5 ml/min under ca 20 minuter. Lysatet filtrerades genom ett 0.45 µm-filter för att avlägsna partiklar som annars kan fastna och täppa till kolonnen. Därefter applicerades lysatet med en flödeshastighet på 2.5 ml/min, varpå kolonnen tvättades med 50 ml inbindningsbuffert (2.5 ml/min) för att avlägsna oönskade proteiner som bundit in till kolonnen. Efter det tvättades kolonnen med 50 ml tvättbuffert (2.5 ml/min). Tvättbufferten innehåller en något högre halt imidazol, vilket ytterligare tvättar bort oönskade proteiner från kolonnen. His-taggat TPMT eluerades därefter från kolonnen med ca 15 ml elueringsbuffert (2.5 ml/min). Ett prov om 100 µl togs ut i varje reningssteg för senare analys med SDS- PAGE. Eluatet sätts därefter på dialys. Önskad längd på dialysslangen mättes upp och slangen lades i avjonat vatten en stund för att mjukna. Därefter förslöts ena änden med klämma och eluatet pipetterades ner i slangen, varpå även den andra änden förslöts. Eluatet dialyserades därefter mot 5 l ekvilibreringsbuffert vid 4 C över natt. Följande dag ekvilibrerades jonbyteskolonnen med ekvilibreringsbuffert på flödeshastigheten 5 ml/min under 20 minuter, medan det dialyserade eluatet överfördes från slangen till ett 50 ml-rör. Efter avslutad ekvilibrering så applicerades det dialyserade provet på jonbyteskolonnen med flödeshastigheten 2.5 ml/min. Därefter applicerades ytterligare ekvilibreringsbuffert (2.5 ml/min) för att fortsätta kromatografin. Voidvolymen samlades upp separat och därefter samlades eluerat TPMT upp i fraktioner om 5 ml. Absorbansen mättes på de uppsamlade fraktionerna och elueringen avbröts när koncentrationen i fraktionen understeg 1 mg/ml. Fraktionerna hälldes samman i ett 50 ml-rör och förvarades vid 4 C. Jonbyteskolonnen tvättades sedan med 2 M NaCl för att eluera proteiner som eventuellt finns kvar på kolonnen. Prover om 100 µl togs ut i varje reningssteg för senare analys med SDS-PAGE. 15 µl av varje prov som tagits ut blandades med 15 µl laddningsbuffert vardera i eppendorfrör. Hål gjordes i varje lock med kanyl, varpå rören och deras innehåll kokades i vattenbad i 5 minuter. Under tiden monterades en SDS-gel i kassett och vanna, som fylldes med elektroforesbuffert. När proverna kokat klart applicerades 10 µl av vardera prov i separata brunnar på gelen. En molekylviktsstandard applicerades också på gelen. Elektroforesen kördes sedan vid 200 V tills banden med bromfenolblått vandrat till slutet av gelen. Elektroforesen avbröts då och gelen togs loss från kassetten. Skyddsglasen bräcktes isär och akrylamidgelen överfördes försiktigt till en bytta med avjonat vatten. Gelen tvättades sedan genom att byttan kördes i micro tills vattnet nästan kokade. Därefter hälldes vattnet av och ersattes med nytt. Detta upprepades 3 gånger. Därefter hälldes istället infärgningslösning över gelen. Infärgningen pågick i ca 5 timmar. Därefter hälldes infärgningslösningen av och rikligt med avjonat vatten hälldes över gelen för att avfärga den. Avfärgningen pågick över natt. Dagen därpå analyserades den avfärgade gelen. Gelen lades på en ljusramp och vandringslängder för molekylviktsstandarden och rent TPMT uppmättes med linjal. Gelen fotades för renhetsanalys. 4

5 Resultat och beräkningar Absorbansmätning vid eluering av TPMT från jonbytesskolonn Voidvolymen uppmättes till 5 ml. Därefter mättes absorbansen på varje 5 ml-fraktion som samlades. Då absorbansen översteg 1 späddes provet. Den absorbans som därefter upmättes användes för beräkning av koncentrationen TPMT med hjälp av Lambert-Beers lag. Kyvetter med längden 1 cm användes vid mätningarna. För TPMT är den molära absorbtiviteten cm -1 M -1, och detta värde har använts vid beräkningarna. För varje absorbansvärde beräknas koncentrationen i provet enligt: c= A l För fraktion 1 uppmättes efter 10 gångers spädning en absorbans på Koncentrationen för det spädda provet beräknas enligt c= = M Det erhållna värdet multipliceras därefter med spädningsfaktorn för att räkna ut koncentrationen i provet innan spädning: c 10= M 10= M Utifrån detta värde omvandlas koncentrationen i molar (mol/l) till koncentration i g/l. Detta görs enkelt genom att multiplicera koncentrationen i molar med molekylvikten, som för TPMT är g/mol: mol/l g/mol=5.6 g/l=5.6 mg/ml Eftersom varje fraktion innehåller 5 ml eluat så beräknas den totala mängden protein i varje fraktion enl 5.6 mg/ml 5ml=28 mg På samma sätt utförs beräkningarna för resterande prover. Rådata och beräknade koncentrationer och mängder redovisas i tabell 1. Datan har sedan använts för att konstruera kromatogrammet i Figur 1. Tabell 1. Rådata från absorbansmätning och beräknad proteinkoncentration. Fraktionsnum mer Uppmätt absorbans Eventuell spädning Uppmätt absorbans efter spädning Koncentration (M) Koncentration (mg/ml) Mängd protein (mg) 1 -* 10X * 10X * 5X * 4X * 2X * Provets absorbans översteg 1 och späddes därför för att hamna inom det linjära absorbansintervallet. 5

6 Den totala mängden TPMT i det poolade eluatet fås genom addition av beräknade mängder protein i sista kolumnen i Tabell 1. Detta ger en total mängd på 75 mg TPMT efter jonbyteskromatografi Kromatogram Jonbyteskromatografi koncentration (M) elueringsvolym (ml) Figur 1. Kromatogram över elueringen från jonbyteskolonn. Analys av SDS-PAGE Figur 2 visar den fotograferade gelen. Innehållet i de olika brunnarna redovisas i Tabell 2. Uppmätta vandringslängder för referensproteinerna redovisas i Tabell 3. Utifrån dessa värden har ett logdiagram konstruerats genom att molekylvikterna för referensproteinerna har logaritmerats och avsatts mot respektive vandringslängd på gelen i mm. Diagrammet redovisas i Figur 3. TPMT Figur 2. Fotografi på gelen från SDS-PAGE. 6

7 Tabell 2. Applicerade prover vid SDS-PAGE. Provbrunn Applicerat prov 1 Molekylviktsstandard 2 Lysat av E coli-celler 3 4 Flow-through från affinitetskolonn Tvätt av affinitetskolonn med inbindningsbuffert 5 Eluat från affinitetskolonn 6 Eluat från jonbyteskolonnen 7 Tvätt av jonbyteskolonn Tabell 3. Vandringslängder för molekylviktsstandard. Vandringslängd (mm) Molekylvikt (g/mol) Log-diagram SDS-PAGE f(x) = -0.02x Logaritmerad molekylvikt vandringslängd (mm) Figur 3. Log-diagram baserat på vandringslängderna för referensproteinerna som används vid SDS-PAGE. 7

8 Genom avläsning i diagrammet i Figur 3 kontrolleras molekylvikten för det framrenade proteinet. Vandringslängden för rent protein på gelen har uppmätts till 40 mm. Genom avläsning i diagrammet fås ett värde på ca Molekylvikten erhålls genom att ta antilogaritmen enligt =26915 Beräknad molekylvikt är alltså ca g/mol. Diskussion Utifrån kromatogrammet i Figur 1 ser vi att TPMT eluerar tämligen omgående från jonbyteskolonnen, eftersom det mesta av proteinet eluerar i de 5-10 ml som följer efter voidvolymen på 5 ml (storleken på kolonnen). Detta stämmer väl överens med att TPMT inte binder in till anjonbytaren vid 100 mm NaCl. Koncentrationen avtar sedan successivt i efterföljande fraktioner, vilket troligen beror på att proteinet späds av elueringsmedlet under passagen genom kolonnen. Vidare har även reningsförfarandet analyserats med hjälp av SDS-PAGE. Utifrån fotot på SDS-gelen i Figur 2 analyseras renheten för det preparerade proteinet och de olika reningsstegen. Då brunnarna för lysat av E coli-celler och flow-through från affinitetskolonn jämförs (brunn 2 respektive 3) kan vi se att TPMT bundit in till affinitetskolonnen, eftersom bandet som motsvarar proteinet saknas i flow-through (se markering vid bandet för TPMT). Eluatet från tvättsteget i brunn 4 visar att flera orenheter tvättas bort i detta steg och eluerar från kolonnen. Eluatet från afftinitetskolonnen i brunn 5 visar tydligt att otaliga orenheter förekommer trots tvättstegen, eftersom flera band syns både över och under TPMTbandet. Det räcker alltså inte med affinitetskromatografi för att erhålla ett rent prov. Eluatet från jonbyteskolonnen visar däremot på ett helt rent protein då bara ett band (molekylvikt motsvarande TPMT) syns. I provet för brunn 7 (tvätteluat från jonbyteskolonnen) återfinns istället otaliga proteiner. Orenheterna eluerar alltså vid högre saltkoncentrationer än TPMT, vilket betyder att vi kunnat separera TPMT från orenheterna genom att selektivt eluera det önskade proteinet medan orenheterna förblir inbundna på kolonnen. Den höga intensiteten för bandet vid en molekylvikt som är något lägre än den för TPMT beror på att mer protein har laddats på gelen i detta prov jämfört med övriga prover på gelen. Sammanfattningsvis är resultatet ett rent proteinprov. Det bekräftar därmed att elueringsprofilen i Figur 1 endast motsvarar TPMT och koncentrationsberäkningarna har alltså inte påverkats av absorbansbidrag från förorenande proteiner. Den experimentellt bestämda molekylvikten på g/mol som har beräknats för det rena proteinet stämmer väl överens med litteraturvärdet på g/mol. Den lilla avvikelse som faktiskt förekommer speglar de felmarginaler som normalt förekommer vid SDS-PAGE och beror sannolikt inte på att ytterligare faktorer påverkat resultatet. Eftersom resultatet stämmer så väl överens med den kända molekylvikten så kan vi dra slutsatsen att det verkligen är TPMT som har renats fram. Eftersom vi fått fram ett så pass rent protein med förväntad molekylvikt så finns det förmodligen inga nämnvärda felkällor i utförandet. Dock kan det inte uteslutas att vi kan ha haft onödiga förluster av protein i de olika reningsstegen, vilket skulle ge mindre utbyte. 8