Laboration Enzymer. Labföreläsning. Introduktion, enzymer. Kinetik. Första ordningens kinetik. Michaelis-Menten-kinetik

Transkript

1 Labföreläsning Maria Svärd Molekylär Strukturbiologi, MBB, KI Introduktion, er och kinetik Första ordningens kinetik Michaelis-Menten-kinetik K M, v max och k cat Lineweaver-Burk-plot Inhibering kompetitiv och icke-kompetitiv Spektrofotometri och Lambert-Beers lag Laborationsgenomgång Enzymet Labmoment Labredogörelsen Säkerhet på lab Introduktion, er Kinetik Enzymer är biologiska katalysatorer som kännetecknas av Katalytisk effektivitet Specificitet Reglerad aktivitet Enzymkatalyserade reaktioner påverkas av Koncentration av och reaktanter Temperatur ph Hämmare/aktivatorer G (fri energi) S P Aktiveringsenergi utan med Kinetik är studier av reaktioners hastigheter Enzymkinetik = reaktionshastighet i atiskt katalyserade reaktioner Bestämning av kinetiska parametrar mått på aktivitet Nollte ordningens kinetik hastigheten oberoende av koncentrationen v=k* 0 Första ordningens kinetik hastigheten proportionell mot koncentrationen v=k* Första ordningens kinetik Michaelis-Menten-kinetik Reaktionshastigheten proportionell mot koncentrationen av Då man studerar atiskt katalyserade reaktioner ser man ofta följande karakteristiska beteende : S k P 0:e ordningens kinetik v oberoende av (mättnad) v d[p] d k dt dt lutning=k [M] :a ordningens kinetik [M]

2 Michaelis-Menten-kinetik Michaelis-Menten-kinetik Michaelis och Menten (93) ställde upp följande modell för att förklara experimentella data: (Analysen modifierad av Briggs och Haldane 925) k k 4 v =v max K M Michaelis-Mentens ekvation k Två antaganden behöver göras: Tillbakareaktionen k 4 försummas (initiala hastigheten) [ES] är oförändrad steady state k 4 där: v max =. [E tot ] maximala reaktionshastigheten och K M = ( + )/k totala koncentrationen ets omsättningstal=k cat Michaelis konstant om >> så är K M ~ /k = K eq (dissociationskonstanten för E + S ES) dvs ets affinitet för et Michaelis-Menten-kinetik Lineweaver-Burk-plot v =v max K M Om man inverterar Michaelis-Menten-ekvationen får man en ekvation för en rät linje. Vi ser att då = K M så är v=v max /2 (?)v max v v v KM max max y = a + k x v max /2 Plottar man sina uträknade mätdata /v som funktion an / får man en Lineweaver-Burk-plot, ur vilken K M och v max lätt kan bestämmas. 0 =K M 0 [M] Lineweaver-Burk-plot Inhibering av aktivitet [min/mol] v v v v KM max max Kompetitiv Icke kompetitiv K M v max 0 [(M) - ] 2

3 Kompetitiv inhibering Kompetitiv inhibering Substratet och hämmaren tävlar om att binda till samma säte på et. Reaktionsschema k +I EI v = vmax + K ' M, K' > K M M Kompetitiv inhibering Icke-kompetitiv (noncompetitive) inhibering Grafiskt: v [min/mol] Substrat och hämmare binder oberoende av varandra till olika säten på et. [M] [(M) - ] KM K M v max oförändrat, K M blir större Icke-kompetitiv inhibering Icke-kompetitiv inhibering Reaktionsschema: Grafiskt: k +I +I EI + S v = v ' max ESI + K M, v ' max < vmax [M] v max K M oförändrat, v max blir mindre v [min/mol] v max [(M) - ] 3

4 Spektrofotometri Spektrofotometri Hur mäter man hastigheten i kemiska reaktioner? En metod är absorptionsspektroskopi spektrofotometri Olika molekyler har olika absorptionsspektrum Absorption av synligt ljus och UV-ljus i en molekyl uppkommer genom excitation av elektroner till nya (högre) energinivåer i de kemiska bindningarna. Ljus av en viss våglängd/energi absorberas när energin motsvarar skillnaden mellan två energinivåer. Absorbans Våglängd [nm] högre energi Spektrofotometri Spektrofotometri Spektrofotometern Absorberande prov med längd l I 0 I l Transmittans: T = I I 0 Absorbans A = -log(t) = - log I = log I 0 I I 0 Praktiskt: Absorbansområdet man mäter inom är ca 0.-. T : 0 Om för högt: SPÄD och mät igen! Om för lågt: gör om för god noggrannhet. A : 0 Lambert-Beers lag Laborationen Lambert-Beers lag: I = I c 0 0- l = molära absorptionskoefficienten l = provets längd c = provets koncentration I = 0- l c A = lc I0 Enzym: Alkaliskt fosfatas Dimer Finns normalt i tunntarmen Klipper bort fosfatgrupper från organiska molekyler Isolerat från ko, men finns också hos människa PDB id zed Om vi mäter A och känner och l, så kan vi beräkna koncentrationen (c). 4

5 Laborationen NO 2 OPO H 2 O Alkaliskt fosfatas NO 2 OH + PO H + Mål: NFF Studera reaktionen (kinetik) Bestämma K M v max ph-optimum Hämningstyp Förstå fotometrins principer para-nitrofenol Labseminarium/genomgång med amanuenser. Förbered svar på frågorna i kompendiet. Kom i tid! Pipetteringsövning. Bestämning av absorptionsmaximum för paranitrofenol (produkten) Beräkning av den molära absorptionskoefficienten, ε Våglängdsscanning nm Absorbans A max 2. Effekten av inkubationstid på mängd bildad produkt X 9 (olika inkubationstid) H 2 O NFF buffert Inkubation vid 40 C (börja med att starta 20 min) Tillsätt stopplösning efter min Läs absorbans inom 5 min max Våglängd [nm] Bestäm våglängden max då absorptionen är maximal. Beräkna vid denna våglängd. + + vatten Rita graf (mängd bildad produkt mot tid) 3. Bestämning av reaktionshastigheten som funktion av ph X 9 (ökande buffert-ph) H 2 O NFF buffert + + vatten 0 min vid 40 C Tillsätt stopplösning Läs absorbans (produkt) Räkna ut mol produkt bildad/min inkubation. Rita graf. 4. Bestämning av K M och v max för et, samt bestämning av hämningstyp X 6 (ökande ) A B C D A B + hämmare (konc. ) C + hämmare (konc. 2) D blankserie /v [min/mol] 0 [M] Rita M-M- och L-B-kurvor. Bestäm därur K M, v max och hämningstyp. Bestäm även K M och v max m.h.a. icke-linjär regression. / 0 [M - ] 5

6 Labrapport 5. Räkneuppgift med et alkoholdehydrogenas Bestäm K M, v max och hämningstyp utifrån värden i labkompendiet Lineweaver-Burk Icke-linjär regression Beräkna promillehalt En rapport per grupp Inlämning senast 6.00 måndag 27/9 Rättning klar senast 6.00 fredag /0 Inlämning via e-post till respektive amanuens Skicka mailet till alla i labgruppen Kopia till maria.svard@ki.se Labrapport Säkerhet på lab Labrapporten ska vara kortfattad och innehålla följande: Titelsida med sammanfattning Introduktion Resultat (se labkompendium) Diskussion Bilagor med originaldata Ange de samband ni har använt vid beräkningarna, visa räkneexempel. Glöm ej att ange enheter i era uträkningar och på axlarna i era grafer. Labrock (skyddsglasögon, handskar) Ej äta eller dricka på lab Munpipettering är förbjuden! Förebygg olyckor Var väl förberedd Arbeta lugnt När man lämnar lab Tvätta händerna Tag av labrocken Använd ditt omdöme! Vi ses på labbet! 6