Linköpings universitet 2007 IFM-Kemi. Enzymkinetik. enzymet mättat på substrat. Hastigheten maximal = V max.

Transkript

1 Linöpings uniersitet 2007 IF-emi Enzymineti hyperbel enzymet mättat på substrat. Hastigheten imal. [S] En reations initialhastighet mäts (spetrofotometrist). Absorbansändringen är protortionell mot oncentrationsändringen t e a bildad produt. Abs tangentens lutning initialhastigheten: d[ P] t 0 ättnadseffeten ledde till att ichaelis-enten 93 postulerade föreomsten a en enzymsubstrat (ES) intermediär under atalysen. eanism: t E + S ES 2 2 E + P illor [S] tot >> [E] tot Härledning a hastighetsse: f ([S])

2 d[ P] d[ ES] 2 [ES] () [E] [S] - - [ES] - 2 [ES] [E] [S] - ( ) [ES] (2) [E] tot [E] + [ES] (3) ([E] tot änd mängden enzym från början) Försö substituera [ES] i eataion () med [S] och i får f ([S])! i har 2 obeanta [E] och [ES] ([S] [S] tot, då [E] tot << [S] tot och därmed [ES] <<[S] tot ). Eftersom i ocså har 2 eationer (2) och (3) an [ES] lösas ut. Efter en ort tid är flödeshastigheten genom det intermediära steget onstant, d s oncentrationen a ES blir onstant. Detta p g a att substratoncentrationen är mycet högre än enzymoncentrationen arid minsningen i substratoncentrationen initialt blir mycet liten. Och eftersom i bara är intresserade a det som ser initialt an i sätta tillstånd steady-state). d [ ES] 0 (stationärt onc. P steady-state S ES mse t [ ES] d Om eation: 0 e (2) förandlas från en differentialeation till en enel algebrais (2) [E] [S] - ( ) [ES] 0 (3) [E] [E] tot - [ES] (3) i (2) ([E] tot - [ES]) [S] - ( ) [ES] 0 ([E] tot - [ES]) [S] ( ) [ES] ( [ ES] ) [ ES] + 2 (ichaelis-enten onst.) 2

3 Lös ut [ES] : [ES] ([ E] [ ES] ) tot [ E ] [ ] tot S - [ ES ][ S ] [ES] + [ ES ] [ ] tot S [ E ] [ ] tot S [ES] (+ [ S ] ) [ES] + + i () : + 2 (4) När uppnås imal hastighet? Jo, då allt enzym föreliger som enzymsubstratomple [ES], ds då [ES] [E] tot och 2 [ES] () 2 [E] tot i (4). ichaelis-enten eationen + 2 cat ; 0 2 s - < cat < 0 6 s - turn-oer number (dim:tid - ) cat [ E ]tot Innebörd a : + ES 2 (E + S 2 E + P) Ofta gäller att - >> 2 (måste doc isas!) ES-ompleet ( ES i Stryer.) dissociationsonstanten för (id jämit gäller att - [ES] [E] [S] (samma hastighet genom första steget) Alltså ES [ E] [ ES] ds jämitsonstant (diss. onst.) för: ES E + S 3

4 har alltså dimensionen : (mol/lit) och anger styran a ES ompleet. Ofta 0-6 < < ärdet antyder hur äl substrat passar enzymet. Lågt -ärde hög substrat affinitet. Eempel på inetistudier a) Några reationsblandningar gjordes upp alla innehållande en onstant mängd enzym. I dessa blandningar arierades substratoncentrationen. Initialhastigheten a den enzymatalyserade reationen mättes spetrofotmetrist, arid µmol bildad produt per minut unde beränas. Från de erhållna försösdata (se tabellen) an och för det undersöta enzymet och dess substrat beränas. Tabell Substrat () (µmol/min) / (min/ µmol) /[S] ( - ) 5, , , , , , , ,030 3,3 0 4, , Bästa sättet att erhålla de söta parametrarna är på s Lineweaer Bur is, arför och beränas (gjort i tabellen). (min/µmol) 0, ( - ) 0-4 4

5 0,05 67 µmol/min - - 3, , ,0 0-5 De mest anändbara substratoncentrationerna är de som ligger i närheten a (från 5 till 0, ). Dessa halter ger de säraste ärdena på de söta parametrarna. Dessutom arbetar enzymerna i cellen med dessa oncentrationer störst fleibilitet [S] 0, 5 b) med hämmare: Enzymet arboanhydras atalyserar följande reation: CO 2 + H 2 O HCO + 3 H+. Initialhastighetens beroende a substratonc. följer - e. Enzymet inhiberas a nitratjoner. Följande resultat erhölls i 2 försösserier, där enzymhalten hölls onstant, men där i det ena fallet en onstant mängd NO 3 (0, ) tillsatts. [CO 2 ] (m) (m/se) utan hämmare (m/se) med 0, NO 3 /[CO 2 ] (m - ) utan I / (se/m) 2,0,0 0,20 0,5,0 5,0 5,0 2,0 0,40 0,2 0,5 2,5 0,0 3,0 0,60 0, 0,33,67 20,0 4,0 0,80 0,05 0,25,25 med I / (se/m) ad allas denna typ a inhibering? ar i enzymet binder inhibitorn enligt den inetisa undersöningen? ad är I? i asätter mot ( och utränat i tabellen). 5

6 (se/m) 4,0 med NO 3 (0, ) 3,0 2,0 (+ [ I ] ) i utan NO 3,0 0, 0,2 0,3 0,4 0,5 (m - ) 0,7 se/m 5,9 m/se OBS! m här : 0,85 0,7 ( ) 0, m 0,68 Nonompeteti inhibering (särning på -aeln) inhibitorn binder till annan plats än substratet 6