Laboration Enzymer. Maria Svärd Molekylär Strukturbiologi, MBB, KI

Transkript

1 Maria Svärd Molekylär Strukturbiologi, MBB, KI Labföreläsning Introduktion - enzymer och kinetik Första ordningens kinetik Michaelis-Menten-kinetik K M, v max och k cat Lineweaver-Burk-plot Inhibering kompetitiv och icke-kompetitiv Spektrofotometri och Lambert-Beers lag Laborationsgenomgång Enzymet Labmoment Labredogörelsen Säkerhet på lab

2 Introduktion - Enzymer Enzymer är biologiska katalysatorer som kännetecknas av Katalytisk effektivitet Specificitet Reglerad aktivitet G (fri energi) S Aktiveringsenergi utan enzym med enzym Enzymkatalyserade reaktioner påverkas av Koncentration av enzym och reaktanter Temperatur ph Hämmare/aktivatorer P Kinetik Kinetik är studier av reaktioners hastigheter Enzymkinetik = reaktionshastighet i enzymatiskt katalyserade reaktioner Bestämning av kinetiska parametrar mått på enzymaktivitet Nollte ordningens kinetik hastigheten oberoende av substratkoncentrationen v=k* 0 Första ordningens kinetik hastigheten proportionell p mot substratkoncentrationen v=k* 2

3 Första ordningens kinetik Reaktionshastigheten proportionell mot koncentrationen av substrat S k P v [mol/min] v d[p] d k dt dt lutning=k [M] Michaelis-Menten-kinetik Då man studerar enzymatiskt katalyserade reaktioner ser man ofta följande karakteristiska beteende : v [mol/min] 0:e ordningens kinetik v oberoende av (mättnad) :a ordningens kinetik [M] 3

4 Michaelis-Menten-kinetik Michaelis och Menten (93) ställde upp följande modell för att förklara experimentella data: (Analysen modifierad av Briggs och Haldane 925) E + S ES E + P Två antaganden behöver göras: k k 2 Tillbakareaktionen k 4 försummas (initiala hastigheten) [ES] är oförändrad steady state k 3 k 4 Michaelis-Menten-kinetik k E + S ES E + P k 2 k 3 k 4 v =v max K M Michaelis-Mentens ekvation där: v max = k 3. [E tot ] maximala reaktionshastigheten totala enzymkoncentrationen enzymets omsättningstal=k cat och K M = (k 2 +k 3 )/k Michaelis konstant om k 2 >> k 3 så är K M ~k 2 /k = K eq (dissociationskonstanten för E + S ES) dvs enzymets affinitet för substratet 4

5 Michaelis-Menten-kinetik v =v max K M Vi ser att då = K M så är v=v max /2 v [mol/min] v max v max /2 0 =K M 0 [M] Lineweaver-Burk-plot Om man inverterar Michaelis-Menten-ekvationen får man en ekvation för en rät linje. v v v KM max max y = a + k x Plottar man sina uträknade värden för /v som funktion av / får man en Lineweaver-Burk-plot, ur vilken K M och v max lätt kan bestämmas. 5

6 Lineweaver-Burk-plot [min/mol] v v v v KM max max K M v max 0 [(M) - ] Inhibering av enzymaktivitet Kompetitiv Icke kompetitiv 6

7 Kompetitiv inhibering Substratet och hämmaren tävlar om att binda till samma säte på enzymet. substrat inhibitor inhibitor enzym substrat enzym Kompetitiv inhibering Reaktionsschema +I k k 3 E + S ES E + P k 2 EI = v v max + K ' M, K' > K M M 7

8 Kompetitiv inhibering Grafiskt: v [mol/min] v [min/mol] med I utan I med I utan I [M] [(M)-] KM K M v max oförändrat, K M blir större Icke-kompetitiv (noncompetitive) inhibering Substrat och hämmare binder oberoende av varandra till olika säten på enzymet. substrat substrat enzym inhibitor enzym inhibitor 8

9 Icke-kompetitiv inhibering Reaktionsschema: k E + S ES E + P +I k 2 k 3 +I EI + S ESI v = v ' max + K M, v ' max < vmax Icke-kompetitiv inhibering Grafiskt: v [mol/min] v [min/mol] med I utan I utan I med I [M] v max v max [(M) - ] K M oförändrat, v max blir mindre 9

10 Spektrofotometri Hur mäter man hastigheten i kemiska reaktioner? En metod är absorptionsspektroskopi spektrofotometri Olika molekyler har olika absorptionsspektrum Absorbans Våglängd [nm] Spektrofotometri Absorption av synligt ljus och UV-ljus i en molekyl uppkommer genom excitation av elektroner till nya (högre) energinivåer i de kemiska bindningarna. Ljus av en viss våglängd/energi absorberas när energin motsvarar skillnaden mellan två energinivåer. högre energi 0

11 Spektrofotometri Spektrofotometern Spektrofotometri Absorberande prov med längd l I 0 I Transmittans: Absorbans l T = I I 0 A = -log(t) = - log I I = log I I Praktiskt: Absorbansområdet man mäter inom är ca 0.-. T : 0 Om för högt: SPÄD och mät igen! Om för lågt: gör om för god noggrannhet. A : 0 0 0

12 Lambert-Beers lag Lambert-Beers lag: l c I = I 0 0- l c = molära absorptionskoefficienten = provets längd = provets koncentration I I I 0 =0 - l c A = l c Om vi mäter A och känner och l, så kan vi beräkna koncentrationen c. Laborationen Enzym: Alkaliskt fosfatas Dimer Klipper bort fosfatgrupper från organiska molekyler Isolerat från ko, men finns också hos människa PDB id zed 2

13 Laborationen NO 2 OPO H 2 O Alkaliskt fosfatas NO 2 OH + PO H + NFF para-nitrofenol Mål: Studera reaktionen (enzymkinetik) Bestämma K M v max ph-optimum hämningstyp Förstå fotometrins principer Laborationens deluppgifter Labseminarium/genomgång med amanuenser. Förbered svar på frågorna i kompendiet. Kom i tid! Pipetteringsövning 3

14 Laborationens deluppgifter. Bestämning av absorptionsmaximum för para- nitrofenol (produkten) Beräkning av den molära absorptionskoefficienten, ε Våglängdsscanning nm Absorbans A max max Våglängd [nm] Bestäm våglängden max då absorptionen är maximal. Beräkna vid denna våglängd. Laborationens deluppgifter 2. Effekten av inkubationstid på mängd bildad produkt X 9 (olika inkubationstid) H 2 O NFF buffert Inkubation vid 40 C (börja med att starta 20 min) Tillsätt stopplösning efter min Läs absorbans inom 5 min + enzym + vatten Rita graf (mängd bildad produkt mot tid). 4

15 Laborationens deluppgifter 3. Bestämning av reaktionshastigheten som funktion av ph X 9 (ökande buffert-ph) H 2 O NFF buffert 0 min vid 40 C Tillsätt stopplösning Läs absorbans + enzym + vatten Räkna ut mängd bildad produkt/min inkubation. Rita graf. Laborationens deluppgifter 4. Bestämning av K M och v max för enzymet, samt bestämning av hämningstyp X 6 (ökande ) v [mol/min] A enzym B enzym + hämmare (konc. ) C enzym + hämmare (konc. 2) D blankserie /v [min/mol] 0 [M] A B C D / 0 [M - ] Rita M-M- och L-B-kurvor. Bestäm K M, v max och hämningstyp. Bestäm även K M och v max m.h.a. icke-linjär regression. 5

16 Laborationens deluppgifter 5. Räkneuppgift med enzymet alkoholdehydrogenas Bestäm K M, v max och hämningstyp utifrån värden i labkompendiet Lineweaver-Burk Icke-linjär regression Beräkna promillehalt Labbok Ingen labrapport ska skrivas - kontrasignerad labbok krävs för godkänd laboration Kortfattad målsättning Utförande Resultat, rådata Beräkningar, grafer Slutsatser Skriv direkt i labboken under laborationen. Ange de samband ni har använt vid beräkningarna, visa räkneexempel. Glöm ej att ange enheter i era uträkningar och på axlarna i era grafer. 6

17 Säkerhet på lab Labrock (skyddsglasögon, handskar) Ej äta eller dricka på lab Munpipettering är förbjuden! Förebygg olyckor Var väl förberedd Arbeta lugnt När man lämnar lab Tvätta händerna Tag av labrocken Använd ditt omdöme! 7