Syra/bas och Energi Kurskod 1BA001

Transkript

1 Institutionen för Laboratoriemedicin Biomedicinsk analytikerutbildningen Termin 2 Syra/bas och Energi Kurskod 1BA001 Laboration: Reduktion av pyruvat med NADH Ulla Andersson Ulla.K.Andersson@ki.se 1

2 Arbetsplan före laborationen: Hela metodbeskrivningen ska vara genomläst inför laborationen! Följande beräkningar ska göras i förväg! Framställning av 50 ml pyruvatlösning se under material. Molmassa för pyrodruvsyra: 88,06 g/mol Framställning av 5 ml NADH-lösning se under material. Molmassa för NADH: 709,4 g/mol Varför använder vi kvartskyvett, vilken annan kyvett skulle vi kunna använda? Vilka pipetter ska vi använda, vilken färg är det på pipettspetsarna till de olika pipetterna? Arbetsplan efter laborationen: Ställ tillbaka allt materiel som Du har tagit fram och torka av bänken! Gör ren kyvetten efter dig! Ställ disken i diskmaskinen! 2

3 Syfte: Syfte med laborationen är att studera reaktionen då pyruvat reduceras till laktat och när β-nicotinamide adenine dinucleotide, reduced form (NADH) oxideras till β-nicotinamide adenine dinucleotide (NAD). Reaktionsformel: LDH Pyruvat + NADH + H + Laktat + NAD + ph = 7,5 Reaktion är samma reaktion som sker då mjölksyra bildas i musklerna. Laktat är mjölksyrans anjon. Absorbansen studeras vid en speciell våglängd och absorbans ändringen med tiden är ett mått på reaktionshastigheten. Vid kinetikmätningar är det initialhastigheten som är intressant. I detta försök studeras hur reaktionen går med tiden. Material: Fosfatbuffert: 0,20 M ph=7,5 Pyrodruvsyra: 6,0 mm i 0,20 M fosfatbuffert ph=7,5 LDH: 20 µl löst i 5 ml fosfat buffert ph = 7,5 NADH: 3,0 mm löst i 0,20 M fosfatbuffert ph=7,5 Kyvett av kvarts (använd samma kyvett till alla mätningar). Varipett med spetsar (100 µl och 1000 µl, om möjligt två av vardera). Spektrofotometer typ LKB styrd från dator eller spektrofotometer typ Ultrospec. Dataprogram för scanning och kinetik. 3

4 Utförande LKB spectrofotometer: Våglängdsscan: 0,20 M fosfatbuffert ph=7,5 Kyvetten placeras i strålgången. Scanna våglängdsområdet nm genom att använda Wawescan-programmet. Wavescan-programmet: Gå in under File/Load Parameters och välj parameterfilen NADH som automatiskt ställer in våglängder och avläsningar av spektrofotometern. Under Parameters /Scan skrivs utan LDH + Era initialer i Titlerutan. Scanningen startas under Run/Standard Scan. Välj scanning för ett prov. Ingen referens. Kontrollera uppgifterna i rutan Sample Loading Instructions och starta. Då scanningen är klar välj Peak find under Data i meny-raden. Ställ in Sensitivity för Peak på hälften och klicka bort övriga alternativ. Peak Width skall vara Standard. Gör en utskrift av kurvan från Peak List menyn. Tillsätt 20 µl LDH-lösning i kyvetten och blanda väl. Enzymet LDH startar redoxreaktionen varvid pyruvatet reduceras till laktat och NADH oxideras till NAD +. Gör en ny scanning som ovan men ändra informationen i Parameters/Scan så att det framgår att det är efter redox-reaktionen. Upprepa proceduren ovan med Peak find och utskrift. Jämför de båda kurvorna. Hur kan man se att reaktionen verkligen ägt rum? Skriv reaktionsformeln med tydliga strukturformler där det framgår vad som oxiderats respektive reducerats. Markera strukturförändringen i NADH som orsakar förändringen i absorbans. Tidsstudie av reaktionen: I detta försök studeras hur reaktionen går med tiden. Man studerar absorbansen vid en speciell våglängd och ser hur den ändras med tiden. Vid kinetikmätningar är det initialhastigheten som är intressant. Välj, utifrån föregående försök, den våglängd som är lämplig. 4

5 Byt programmet till Kinetics. Detta program följer absorbansändringen med tiden vid en viss våglängd. Använd parameterfilen NADH och ställ in våglängd och avläsningstider. 0,20 M fosfatbuffert ph=7,5 Placera kyvetten i strålgången, tillsätt 10 µl LDH-lösning, blanda snabbt och starta avläsningen till datorn. Reaktionstiden är två min. Studera kurvans utseende. Hur kan initialhastigheten bestämmas? Vad visar absorbansförändringen vid detta försök? Laborationsrapport: Ingen 5

6 Utförande Ultrospec spectrofotometer: Våglängdsscan: 0,20 M fosfatbuffert ph=7,5 Kyvetten placeras i strålgången. Starta spektrofotometern, tryck på 2 för Applications, tryck på 1 för Wavescan, ställ in start wavelength 250 nm, OK med F3, ställ in end wavelength 500 nm OK med F3. Under Scan Option väljer Du alternativet medium, OK med F3 och sedan väljer Du alternativet peak table on, OK med F3. Reference tryck på grön knapp, apparaten nollställer absorbansen inom hela mätområdet. Tillsätt därefter: Blanda väl genom att röra om och starta genom att trycka på grön knapp. När scanningen är färdig, går Du in under Data genom att trycka på F3, gör peakfind genom att flytta kursorn med pilarna F1 och F2. Läs på raden för Data där Du finner absorbansvärdena för skanningen, spektrofotometern markerar dessutom topparnas maxabsorbanser med en flagga. Du får rita av kurvan eller så får Du en kopia av läraren, markera vilka våglängder som det är maximum absorbans vid och dess absorbansvärden. Döp denna timescan till utan LDH. Tillsätt 20µL LDH-lösning i kyvetten och blanda väl genom att röra om. Enzymet LDH startar redox-reaktionen varvid pyruvatet reduceras till laktat och NADH oxideras till NAD +. Gör en ny scanning som ovan, genom att trycka på grön knapp, rita av kurvan gör peakfind och markera vilka våglängder som det är maximum absorbans vid nu och dess absorbansvärden.. Döp denna timescan till tillsatt LDH. Du får rita av kurvan eller få en kopia av läraren. Jämför de båda kurvorna. Hur kan man se att reaktionen verkligen ägt rum? Skriv reaktionsformeln med tydliga strukturformler där det framgår vad som oxiderats respektive reducerats. Markera strukturförändringen i NADH som orsakar förändringen i absorbans. 6

7 Exit tryck röd knapp. Besvara frågan med Yes Tidsstudie av reaktionen: I detta försök studeras hur reaktionen går med tiden. Du studerar absorbansen vid den våglängd som Du har valt utifrån våglängdsscanningen. Vid kinetikmätningar är det initialhastigheten som är intressant. 0,20 M fosfatbuffert ph=7,5 Tryck först 2 för Applications och sedan 2 för Simple kinetics, ställ in vald våglängd tryck OK med F3, Time units välj alternativ 1 seconds tryck OK med F3, Duration skriv 120 seconds tryck OK med F3, Intervall skriv 5 seconds tryck OK med F3, Print data table välj alternativ 2 dvs on tryck OK med F3. Reference tryck på den gröna knappen och absorbansen blir satt till 0. Tillsätt: LDH i fosfat buffert ph = 7,5 20 µl blanda snabbt och starta avläsningen genom att trycka på den gröna knappen. Reaktionstiden är två min. Studera kurvans utseende. Hur kan initialhastigheten bestämmas? Vad visar absorbansförändringen vid detta försök? Exit tryck röd knapp. Besvara frågan med Yes. Stäng av spektrofotometern Laborationsrapport: Ingen 7