Analytisk kemi och Biokemisk metodik, 7.5hp

Transkript

1 Institutionen för Laboratoriemedicin Biomedicinska Analytikerprogrammet Analytisk kemi och Biokemisk metodik, 7.5hp Laborationer Simuleringsprogram för T3 HT 2010 ADRESS BESÖKSADRESS TELEFON Karolinska Institutet Karolinska Institutet vx LABMED 8100 Alfred Nobelds Allé Huddinge Huddinge

2 INNEHÅLLSFÖRTECKNING Arbetsbok 3 Lab. 1: HPLC och GC-kolonner 4 Lab. 2: Uppsättning och test av utrustning för 11 Lågtryckskromatografi Lab. 3: Centrifugering: Preparation av mitokondrier 23 Simuleringsprogram 34 2 (37)

3 Arbetsbok Varje försök skall dokumenteras så att Du eller en kollega skall kunna göra om försöket på samma sätt. Antingen skriver man upp allt eller annars kan man hänvisa till en metodbeskrivning, (i det här fallet Labkompendium ) men då måste alla avvikelser från instruktionen noteras. Anteckna i boken under tiden Du arbetar, vänta inte tills försöket är klart (då finns det alltid något annat som måste göras)! Det är lämpligt att ge kompendiet en förkortning i början och sedan bara hänvisa till den samt sida för varje moment. Om protokollet t.ex. anger minst 1 timme, bör Du ange hur lång tid det tog i det aktuella fallet. Specificera utrustning t.ex. centrifuger, spektrofotometer och liknande. För att försöket skall kunna upprepas bör man ange leverantör för finkemikalier och kit. Kritiska reagens med begränsad hållbarhet t.ex. enzymer och antikroppslösningar kan vara bra att identifiera med batchnummret. Viktigt är också att alla rådata och beräkningar finns med, inte bara resultatet av beräkningarna. Varje gång man redovisar ett resultat bör man kommentera resultatet. Skriv ner det Du tänkte Sådana kommentarer underlättar mycket när man tittar på resultatet efter två månader. Alla misstag skall noteras, även om man är ganska säker på att det inte har någon betydelse för resultatet. Skriv inte för kompakt, ofta vill man gå tillbaks och skriva kommentarer när man fått mer resultat. Ett bra sätt är att bara skriva på varannan sida. Boken blir lättare att läsa om Du strukturerar med rubriker. 3 (37)

4 Separation med hjälp av HPLC. Första delen av laborationen visas en HPLC-utrunstning från Agilent och demonstationen ska ge grundläggande information om hur ett HPLC-system fungerar. Andra delen får man öva sig på ett simuleringsprogram. Denna övning ska ge information om kromatografisk separation med HPLC. Genom att ändra olika parametrar kan man påverka en separation av två eller flera substanser. Ett prov med en blandning av anisol och metylbensoat används som exempel i detta fall. 4 (37)

5 Övning på simuleringsprogrammet för HPLC. Starta programmet och gå igenom alla val i huvudmenyn. Valen avslutas med OK eller Done. Solvents : Förslagsvis börjar man med metanol som organisk modifierare i den mobila fasen. Columns : Förslagsvis väljs en Waters C-18 kolonn först. Detector : Välj en variabel våglängd som absorberas av substanserna förslagsvis 225nm. Glöm ej Power On! Samples: Välj Sample Drawer Load benzanis.spl. Gå till Control Panel för att starta kromatografen. Sätt Power och Pumps på ON respektive RUN. Ställ in Flow på 1 ml/min, Inj.Vol. på 10 µl, ISOCRATIC MODE och blandningen till 55%B. 1. Vilken substans är mest polär? 2. Förklara varför. Tryck på Inject sample för att köra provet. Om inget händer står felmeddelandet i message rutan. 3. Vilka retentionstider får substanserna? 4. Vilken substans representerar topp 1? 5. Varför kommer den först? 6. Blir det någon skillnad i retentionerna när man byter till en Merck C8 kolonn? 7. Försök att förklara varför (information om kolonndimensioner finns i HPLC simulation, help-texts). (kolonnvolym 8. Vad skulle hända om man bytte till en C4 fas med samma kolonndimension? Byt mobilfas till acetonitril och använd Waters C18 kolonn. 9. Vad händer om man ändrar den organiska modifieraren från en mer polär till en mindre polär? Varför? 5 (37)

6 Känsligheten är för bra vilket visas att topparna inte får plats i kromatogrammet. Byt till en annan känslighet i Detectorsensitivity så topparna inte slår i taket. 10. Vilken känslighet på detektorn behövs? 11. Ge förslag på hur man kan ändra känsligheten utan att ändra detektorns utslag. Tips! Lambert-Beers lag Byt våglängd till 250 nm. 12. Vad händer? Förklara. Byt tillbaks till våglängd till 225 nm. 13. Ändras retentionstiderna om flödeshastigheten ändras? 14. Hur ser topparna ut med avseende på känsligheten och separationen? Förklara. Tips! Arean ska vara lika för 1 ml/min kromatogrammet och basen på toppen blir smalare för 2ml/min kromatogrammet respektive ökad flödeshastighet i en van deemter kurva. Ställ tillbaka flödet till 1 ml/min. och ändra detektorinställningen till diode array. Välj sedan i Computer Data system- Data Diode Array Options - 3D Perspective surface plot. Vad visas? Välj sedan Data Diode Array Options -Chromatograme at given wavelength. Prova med t ex 240 nm och 270 nm. Jämför resultaten. Ändra injektionsvolymen till 4 µl och mobilfassammansättningen till 40% acetonitril. Välj sedan Data Diode Array Options -Chromatograme at given wavelength och ställ in våglängden 240 nm, Spara kromatogrammet som 240nm.cgm Ändra sedan våglängden till 225nm med 40% acetonitril och injicera om lösningen i Computer Data system under Instrument-inject sample. Spara detta kromatogram som 225nm.cgm. Jämför kromatogrammen genom att välja genom att välja compare two chromatograms och välj de båda sparade kromatogrammen. 15. Vad visas? Beskriv och förklara. 6 (37)

7 16. Vad finns det för fördel med att välja den detektionsselektiva våglängden 240nm i detta fall? Ställ in pumpen med gradientinställning. Och ställ in följande parametrar injektionsvolym: 5 µl våglängd: 225 nm Försök sedan att välja rätt gradientprofil, lösningsmedel, kolonn, detektorkänslighet och flöde för att kunna baslinjeseparera substanserna inom 2 minuter och inte överladda signalen. Maximala trycket får inte överstiga 2000 psi. 17. Förklara hur och varför gradienten påverkar retentionen. OBS Muntlig genomgång med samtliga deltagare efter laborationen Alla ska medverka och diskutera svaren på frågorna. Ingen laborationsrapport lämnas in. Kunskaperna redovisas på tentamen 7 (37)

8 HPLC simulation, help-texts Control Panel Click on the power switch to turn on the instrument and activate the status readout. Before injecting a sample. the pumps must be turned on and the flow rate. mobile phase composition and injection volumes set to the desired values. Typical values are as follows: Flow rate = 1.0 ml/min Composition (%B) = 80% Injection volume = 10 µl The gradient panel may be activated by clicking on the isocratic/gradient switch. Once the instrument is set up. the sample injection may be initiated either from this panel (by clicking the "Inject Sample" button). or from the Computer Data System module. In either case, the instrument checks for system readiness before permitting the injection Any problems preventing injection are indicated on the status readout. Columns Commercial reversed-phase columns vary in efficiency depending on particle size, particle coating, and column dimensions. The columns listed here have the following specifications: Brand particie size (microns) Dimensions (cm) DuPont C 18 6,0 23,0 X 0,46 DuPont C 8 6,0 23,0 X 0,46 Waters C 18 10,0 30,0 X 0,39 Merck C 8 10,0 25,0 X 0,46 Hypercil C 18 6,0 16,0 X 0,50 In the general, columns containing more particles will provide greater separation efficiency at expense of longer elution times. Solvent system A binary solvent system suitable for reversed-phase HPLC consists of a mixture of water and one of the available organic solvents listed here. Mean solvent strength index values are as follows: 8 (37)

9 Methanol (MEOH) 3,0 Acetonitrile (ACN) 3,1 Tetrahydrofuran (TEF) 4,4 In principle, solvents with larger strength indices should be more effective for resolving solute components with similar structures properties. Samples Samples may be prepared by beginning with an empty vial and adding standard compounds, or by having the computer generate an unknown. Samples are automatically stored in the sample drawer as they are prepared, Any sample can be retrieved later to be spiked with a standard compound or injected into the HPLC. The most recent sample prepared or retrieved from the drawer is the active sample - the one to be injected. Samples may be saved as disk files for retrieval in a subsequent session. Detector Click on the power switch to turn the detector on. The operating mode of the detector can be selected by elicking on the button to the right of the appropriate label. The UV wavelength for the "Variable Wavelength" mode can be selected by adjusting the slider control. The "Diode Array" mode scans all UV wavelengths simultaneously, but the wavelength used for the plotter output is the one selected as above. Chromatograms at other wavelengths may be plotted by the Computer Data System. The sensitivity on the detector may be adjusted by clicking on the appropriate button. The Computer Data System (CDS) The Computer Data System (CDS) monitors the HPLC system and allows the operator to initiate a run (injection) from the computer to facilitate data acquisition. The chromatographic output is obtained directly by the computer so as to be available for storage and analysis. Use the "inject" option from the INSTRUMENT pull-down menu to acquire a chromatogram. Data analysis options, accessed via the DATA pull-down menu, are active only if a sample has been injected or a chromatogram file has been retrieved via the FILE menu. Diode array options are active only if a 9 (37)

10 sample has been injected with the detector set to "diode array". Samples Phenol: p-nitrophenol p-chresol: 2,5-xylenol: Methylbensoat: Anisole: Benzene: Phenetole Toluene: 10 (37)

11 GC-kolonners egenskaper. Dag 1 (som Gr1 utför och Gr2 och 3 läser igenom noga). Inledning Gaskromatografikolonner har olika polaritet beroende på den stationära fasen. Denna laboration går ut på att bestämma polariteten och upplösningen på fyra st GC-kolonner som är monterade i olika gaskromatografer. Man kan få en uppfattning om kolonnens polaritet genom att analysera en blandning av cyklohexan, butanon och etanol. Dessa ämnens kokpunkter ligger nära varandra (se Handbook) men polariteten är olika, etanol är mycket polär medan cyklohexan är opolär. Butanon är något polär. Cyklohexan, butanon och etanol finns blandade i en provlösning i volymsförhållandet 1:2:4 varigenom man kan identifiera respektive substans genom mängdförhållandet. Utförande Spruta in 1 µl (P-E 8310 skall ha 0,5 µl!) av provlösningen i varje gaskromatograf. Använd den metod för automatisk integrering som är avsedd för laborationen. Utvärdering Studera retentionstiden för respektive substans. Då de detekteras olika vid olika tillfällen är det ej säkert att mängdförhållandet mellan cyklohexan, butanon och etanol blir precis 1:2:4, men etanol är det som det finns mest av och cyklohexan finns det minst av! Studera även kolonnens upplösning. Drag slutsatser om respektive kolonns polaritet ur ovanstående. Tag reda på den stationära fasens egenskaper, namn och struktur. Stämmer resultaten med teorin? 11 (37)

12 Instuderingsfrågor till GC-kolonner 1. Beskriv uppbyggnaden av en packad kolonn respektive en kapillärkolonn för gaskromatografi. Skillnader i storlek, form och separationsförmåga skall framgå. 2. Beskriv, gärna med en figur, hur en flamjonisationsdetektor fungerar. 3. Vid fettsyraanalysen i våras derivatiserades provet dvs. fettsyrorna metylerades med hjälp av metanol och svavelsyra. a) Varför måste man metylera fettsyrorna? b) Vi använde oss av temperaturprogrammering C. Varför gjorde vi det? c) Hur kunde vi ur kromatogrammet bestämma vilka fettsyror som fanns i provet? d) Hur kunde vi ur provet bestämma den procentuella sammansättningen av olika fettsyror i provet? 4. Apiezon L är en blandning av högkokande kolväten med opolära egenskaper. Apiezon L kan användas som stationär fas i GC-kolonner. Man injicerar en blandning av butanon, cyklohexan och etanol i en GC-kolonn som har Apiezon L som stationär fas. I vilken ordning kommer de tre komponenterna ut? Motivera svaret! 5. Carbovax är en polyeter med polära egenskaper. Carbovax kan användas som stationär fas i GC-kolonner. Man injicerar en blandning av butanon, cyklohexan och etanol i en GCkolonn som har Carbovax som stationär fas. I vilken ordning kommer de tre komponenterna i blandningen ut? Motivera svaret! 6. Hur kan man säkert bestämma retentionstiden för butanon, cyklohexan och etanol? 12 (37)

13 Dag 2 (Gr1a undervisar Gr2 och Gr1b undervisar Gr 3) Gr1a/Gr2 Genomför laborationen enligt punkterna ovan Byter lab med Gr1b/Gr3 och diskuterar och besvarar Instuderingsfrågorna Gr1b/Gr3 Diskuterar och besvara Instuderingsfrågorna Byter med Gr1a/Gr2 och genomför laborationen Ingen laborationsrapport lämnas in. Kunskaperna redovisas på tentamen. 13 (37)

14 Uppsättning och test av utrustning för lågtryckskromatografi Syfte: Att få erfarenhet av hur utrustningen för lågtryckskromatografi fungerar så att du lätt kan använda utrustningen då du ska rena karboanhydras från erytrocyter med hjälp av affinitetskromatografi (se Projekt) Dag 1 (som Gr2 utför och Gr1 och 3 läser igenom noga).. Utförande: Material: pump UV-monitor fraktionssamlare skrivare kolonn 14 (37)

15 Uppsättning av apparatur 1. Anslut apparaturen till elnätet. Vilka enheter ska kopplas ihop? Hur då? 2. Sätt på lampan på UV-monitorn. 3. Sätt i pumpslang enligt beskrivning i Bilaga 1 ( Assembling the pump tubing ). 4. Sätt i slangar i pumpen enligt beskrivning i Bilaga 2 ( Connecting the pump ). 5. Bli bekant med kolonn och adaptor genom att läsa separat manual Econo- Column Flow Adaptor Instruction Manual Framför allt Section 1-3. Fundera på nedanstående frågor och utför ihopkopplingarna 6. Till vilka delar av utrustningen ska pumpslangarna anslutas? 7. Till vilken enhet ska utflödet från kolonnen anslutas? Hur då?(hjälp: Bilaga3) 8. Till vilken enhet ska utflödet från UVmonitorn anslutas? 9. Bli bekant med pumpen genom att testa dess funktioner (Hjälp: Bilaga 4). 10. Pumpa in buffert i hela systemet. Tänk på att det inte får vara luft någonstans. 15 (37)

16 11. Nu ska du packa kolonnen med gel.? Hur ska du göra för att slippa luft i undre delen av kolonnen? Hur ska du göra för att slippa luft i adaptern Tillsätt gel till kolonnen. Hur då? 12. Sätt på adaptern och se till att systemet är tätt Hur då? ( Lite hjälp kolonnmanual Section 3). 13. Starta pumpen och se till att du får ett flöde på 1mL/minut. Hur gör du?(lite vägledning finner du i Bilaga 4). Mätglas och tidtagarur är bra hjälpmedel Inställning av apparatur Koppla in fraktionssamlaren och sätt in några rör. Använd Simple time based collection enligt beskrivning i lathunden under fraktionssamlaren så att den byter fraktion efter 5mL. Sätt in känslighet 1 AU på UV monitorns kontrollpanel och sätt på skrivaren. För att skrivaren ska ge samma absorbans, som UV-monitorn registrerar måste skrivaren kalibreras (se nedan). 16 (37)

17 Välj lämplig pappershastighet på skrivaren (Vilken?) så att du lätt ska kunna se vilken/vilka fraktioner som kommer att innehålla protein. Var bör du placera pennan när du startar kromatografin? Starta alla enheter samtidigt och låt det gå 15 minuter. Kontrollera att allt fungerar. ( Vid behov felsökning) Klart!! Plocka isär utrustningen så att nästa grupp får starta från början. Instuderingsfrågor 1. Den gel ni packat i kolonnen är Sephadex G-75. Vilket fraktioneringsområde har denna gel? 2. Rita in och förklara hur elueringsprofilen skulle se ut om ditt prov innehöll proteiner med molmassa 30000,45000, 60000, 75000, och om du använder a) Sephadex G-75 b) Sephacryl S a) Varför har man absorbans på y-axeln? b) Varför våglängd 280 nm? 17 (37)

18 4. a) Du har/ska packa(t) en pelare med 3 ml Sephadex G-75. För att du ska få en bra separation av proteinerna i ditt prov rekommenderar fabrikanten att provvolymen ska vara 1 % av gelvolymen. Hur mycket prov kan du sätta på? (Jämför detta när du renar karboanhydras med hjälp av affinitetskromatografi). b) Du behöver betydligt mer material för dina undersökningar och vill därför sätta på 1mL av ditt prov. Hur stor måste gelvolymen då vara? c) Vilken kolonn bör du då använda? I fönstret ligger flera kolonner. Motivera vilken du väljer Dag 2 (Hälften av Gr2 (Gr2a) undervisar Gr1 och andra hälften av Gr2 (Gr2b) undervisar Gr 3). Gr2a/Gr1 Sätter upp kromatografiutrustningen enligt punkterna ovan Byter lab med Gr2b/Gr3 och diskuterar och besvarar Instuderingsfrågorna Gr2b/Gr3 Diskuterar och besvara Instuderingsfrågorna Diskuterar frågorna som ställs i Utförande så att ni vet precis hur alla kopplingar ska ske när ni byter lab med Gr2a/Gr1 Ingen labrapport behöver lämnas in. Kunskaperna visas under Projektet och redovisas vid Tentamen 18 (37)

19 19 (37) Bilaga 1

20 20 (37) Bilaga 2

21 21 (37) Bilaga 3

22 22 (37) Bilaga 4

23 PREPARATION AV MITOKONDRIER Syfte: Att isolera cellorganeller är vanligt på många forskningslaboratorier för att studera olika cellulära förlopp, som t ex andningskedjan. Centrifugering är den metod som används. Du ska nu ur kycklinglever isolera mitokondrier från andra cellorganeller med hjälp av två olika centrifugeringsmetoder, differential-respektive gradientcentrifugering (görs delvis teoretiskt) och avgöra vilken mitokondriepreparation som är renast. Detta görs genom att analysera ett markörenzym, som t ex malatdehydrogenas, vilket enbart finns i mitokondriens matrix och inte i andra cellorganeller. Tag med stenciler från föreläsningen i centrifugeringsmetoder Teori: Differential-respektive gradientcentrifugering läs kapitel 3 och stencilerat material. När mitokondrier behandlas med en detergent som t ex Deoxycholat (DOC) förstörs både ytter och innermembranet vilket resulterar i att matrixenzym som maladehydrogenas frisättes och dess aktivitet kan mätas genom att följa minskningen av NADH: s absorbans (ΔA/min) vid 340 nm om oxalacetat används som substrat. malatdehydrogenas Oxalacetat + NADH Malat + NAD + + H + Då ε=6,22 cm -1 mm -1 för NADH kan malatdehydrogenasets aktivitet beräknas som μmol min -1 ml -1 mitokondriepreparation. Proteinmängden i de två mitokondriepreparationerna bestäms med metod beskriven av Bradford varvid malatdehydrogenasets specifika aktivitet μmol min -1. mg -1 protein kan beräknas och preparationernas renhetsgrad kan avgöras, d v s högst specifik aktivitet har den renaste preparationen. Varför? 23 (37)

24 Dag 1 (som Gr3 utför och Gr1och 2 läser igenom noga och utför Förberedelser och svarar på frågorna). Förberedelser: Gör följande beräkningar före laborationen: I. Räkna ut hur många milligram Du ska väga upp för att bereda följande lösningar: 4 ml 3,8 mmol/l NADH; molmassa 709,g/mol 2 ml 6,0 mmol/l oxalacetat; molmassa 132g/mol II. Du ska göra buffert A, B och C. Du behöver 0,5 L buffert A och 0, 25L av buffert B och C. Du har två stamlösningar 0,1 M Tris-HCl ph 7,8 0,2 M EDTA Sackaros i burk, molmassa 342,3 g/mol Beskriv, med beräkningar, hur du bereder dessa buffertar III. Beräkna varvtal för de olika rotorerna vid angivna g-tal IV. Gör upp ett försöksprotokoll för proteinbestämning enligt Bradford (se sid 31) V. Besvara de frågor som förekommer i labförelägget Materiel och kemikalier Homogenisator Beckman J21 kylcentrifug med rotor JA-18 Beckman ultracentrifug med rotor SW 28, demonstration Spektrofotometer Dator Färsk kyclinglever (den får inte ha varit fryst!) Varför? 10% Triton X-100 Buffert A: 10 mm Tris-HCl, 2 mm EDTA, 0,25 M sackaros, ph=7,8 Buffert B: 10 mm Tris-HCl, 2 mm EDTA, 1,0 M sackaros, ph=7, 8 Buffert C: 10 mm Tris-HCl, 2 mm EDTA, 1,5 M sackaros, ph=7,8 24 (37)

25 Buffert A, B och C skall vara väl kylda. 0,10 M fosfatbuffert ph=7, 4 3,8 mm NADH i 0,10 M fosfatbuffert ph=7,4 6,0 mm oxalacetat i 0,10 M fosfatbuffert ph=7, 4 De två sista lösningarna förvaras i isbad Utförande: Gradientcentrifugering (dessa moment gör även Gr 1 och 2 Dag 2) Gör en icke kontinuerlig gradient genom att tillsätta 15 ml buffert C i ett centrifugrör SW och därefter 15 ml buffert B (försiktigt utmed rörets sida). Lagra buffert A ovanpå upp till 3 mm från centrifugrörets övre kant (varför är det viktigt med 3mm?). För ner röret i en kopp, se till att röret har rätt hatt Häng upp kopp med hatt på den plats i rotorn som har samma nummer Placera rotorn i ultracentrifugen Starta vaccumpump (varför måste luften bort?) Vi skulle egentligen centrifugerat vid g (varvtal?) i 90 min. Vi centrifugerar inte utan släpper in luft och tar ut rotorn. Vi skördar gradienten genom att låtsas att mitokondrierna finns i interfasen mellan buffert B och C. Sug försiktigt av en del av ovanfasen med Pasteurpipett kopplad till vattensug (kastas) Interfasen sugs upp med en 5mL spruta med en nål i 90 vinkel. Differentialcentrifugering Kycklinglever, ca 8 g, klipps i små bitar i buffert A (isbad) 2. Leverbitarna homogenisera med glas-teflon-homogenisator (440rpm, 4 ggr upp och ner) i buffert A till ett 20 % (w/v) homogenat (Slutvolym), isbad,(detta 25 (37)

26 moment gör vi i centrifugrummet på Patologen,plan5, F-huset. Rören tareras (betyder vad då?) Centrifugera i kylcentrifug, rotor JA18, vid 2000 g (varvtal?) i 10 minuter. (Vad betyder tidsangivelsen?). Pelleten innehåller kärnor och celldebri. Häll försiktigt av supernatanten till ett nytt centrifugrör tills en ljusgult sträng syns Supernatanten centrifugeras vid g (varvtal?) i 15 min i kylcentrifug med rotor JA18 Suspendera pelleten (som innehåller?) i 5 ml buffert A. Mitokondriepreparationen från Differentialcentrifugeringen ska nu användas för enzymaktivitetsmäning och proteinbestämning. Ta 500 µl av mitokondriepreparationen (resterande sparas i kylrum till dag 2 för demonstration) Tillsätt 10µl 5%DOC (deoxycholat) i omgångar tills lösningen är klar (varför?) Mät Malatdehydrogenasaktiviteten i provet inne på apparatlab. Enzymaktivitetsmätning: malatdehydrogenas Oxalacetat + NADH Malat + NAD + + H + Kontroll av apparaturens (gamla spectrofotometrarna) inställningar Sätt in våglängd 340 nm på spektrofotometern Spektrofotometern nollställs med buffert, och därefter rörs inte Set Ref-knappen under hela aktivitetsmätningen. Sätt på en närstående PC. Kontrollera att sladden är inkopplad mellan serieport 1 (S1) på datorn och data-utgången på spektrofotometern. 26 (37)

27 Logga in på Lkb (lösenord: Applab) Välj Windows. Dubbelklicka på ikonen för Kinetics. Du får upp en bild liknande den nedan på skärmen. Klicka på File och sedan på Load Parameters. Välj malat.ek2 för att få alla inställningar för spektrofotometern Klicka på Parameters - Assay för att kontrollera parametrarna för spektrofotometern, ändra om nödvändigt: Våglängd: 340 nm Mättid: 00:30 Tid mellan avläsningarna: 0:02 Klicka sedan på OK eller tryck på Enter. Klicka på Controls och det skall vara kryss i rutorna för Display, Save och Spreadsheet. OBS! inte kryss i Print. Mätning 1. Klicka på Run. 2. Klicka OK i rutorna för Select Assays och Substrate Identity. 3. Då rutan Enzyme Kinetics visas blandas i en kyvett. 0,10 M fosfatbuffert ph=7,4 2,67mL 3,8 mm NADH i fosfatbuffert ph=7,4 0,2 ml 6,0 mm oxalacetat i fosfatbuffert ph=7.4 0,1 ml 4. Blanda ordentligt med hjälp av pinne så att lösningen blir homogen. 27 (37)

28 5. Placera kyvetten i strålgången. Stäng locket över kyvetthållaren, tryck Enter på PC:n så startar mätningen av eventuell spontanaktivitet. När mätningen är klar gå in på Data, Slope och anteckna värdet på ΔA/min (slope). Kontrollera även att kurvan på skärmen för din mätning är linjär (om inte kan det vara en god idé att göra om mätningen). 6. Gör om punkt 1 och 2 (medan kyvetten sitter kvar i spektrofotometern) (kyvetten sitter kvar i spektrofotometern) och vid punkt 5. tillsätt 30 µl prov och blanda ordentligt med hjälp av pinne. Stäng locket över kyvetthållaren, tryck sedan på Enter på PC:n så startar mätningen av enzymaktiviteten. Avläs slope-värdet och kontrollera linjäriteten på kurvan. 7. Då mätningen är klar upprepas proceduren, punkt 1-6, för nästa prov (dubbelprov) Kontroll av de nya spektrofotometrarnas (Ultrospec 2100) inställningar Sätt på spektrofotometern Välj Accesory i den nedre menyn, klicka på OK för Eight poistion cell changer, YES för Treat as single cell och OK för Reload cell changer prompt. Välj sedan Application i den stora menyn och därefter Reaction rate. Gör följande inställningar 1. Wavelength: 340 nm; 2. Time units: seconds; 3. Delay time: 0 ; 4. Duration time: 50; 5. Factor: 1. Som referens används buffert (samma som till de kommande mätningarna). Mätning: 1. Blanda i en kyvett 0,10 M fosfatbuffert ph=7,4 2,67 ml 3,8 mm NADH i fosfatbuffert ph=7,4 0,2 ml 6,0 mm oxalacetat i fosfatbuffert ph=7.4 0,1 ml 2. Blanda omedelbart ordentligt och placera kyvetten i strålgången. Stäng locket över kyvetthållaren. Tryck sedan på Run knappen (den gröna knappen) så startar mätningen av spontanaktiviteten. När mätningen är klar avläs värdet för Slope (ΔA/min), tryck på Graph och kontrollera att kurvan för din mätning är linjär (om inte kan det vara en god idé att göra om mätningen). 3. Låt kyvetten sitta kvar spektrofotometern och tillsätt 30 μl prov och blanda ordentligt med hjälp av pinne. Stäng locket över kyvetthållaren och tryck 28 (37)

29 sedan på Run knappen så startar mätningen av enzymaktiviteten. Avläs slopevärdet och kontrollera linjäriteten på kurvan 4. Gör dubbelprov (dvs upprepa mätningen och kontrollera att ni får ungefär samma slope - värde Beräkna spec. aktivitet för malatdehydrogenas i provet. Avläs ΔA/min För att beräkna mängden av bildad produkt per min och ml enzymlösning (mle) ska du använda följande formel för bestämning av initialhastigheten vo vo = ΔA Vkyv / ε. l ml P Enhet: mmol/min ml E (gör sedan om till μmol/min ml E) Ovanstående ekvation behöver du inte kunna eftersom den kan härledas från Lambert- Beers lag ΔA= c ε. l (Kyvettbredd, l, = 1,0 cm; Absorbanskoeffecient, ε., mm -1 cm -1 ) som du ska kunna. i) Du börjar med att teckna koncentrationsförändringen med tiden Δc = ΔA / ε. l (ε.,= 5,0 mm -1 cm -1 ) Enhet: mmol/l min ii) iii) Därefter teckna ekvationen för mängden bildad produkt per min Δn =ΔA Vkyv / ε. l (Vkyv = slutvolym i kyvett uttryckt i L, t ex 3ml = L) Enhet: mmol/min För att få vo, dvs mängden bildad produkt per min och ml enzymlösning måste du dividera ovanstående uttryck med mlp (t ex 10μL P= ml provlösning) vo = ΔA Vkyv / ε. l ml P Enhet: mmol/min ml E (gör sedan om till μmol/min ml P) iv) För att kunna beräkna den specifika aktiviteten, d v s vspec = vo /proteinhalten dvs μmol mlp/min mg protein/ mlp Enhet: μmol/min mg måste proteinkoncentrationen (mg protein/ml P) bestämmas i proverna enligt nedanstående beskrivning. Proteinbestämning görs enligt Bradford (Makrometoden, se nedan). 29 (37)

30 Gör en standardkurva med 0.1% bovint serum albumin (BSA) som proteinstandard. Använd 8 olika koncentrationer med mellan 0 och 70 µg protein per mätpunkt. Som standard används 0.1% BSA. Vilka volymer av standarden ska du ta för att ligga inom intervallet 10-70µg? Observera att absorbansen skall vara mellan 0,2 och 0,8 absorbansenheter för den användbara delen av kurvan. Proven späds så att absorbansen kommer inom samma område. Detta innebär att provet späds 10 ggr och av denna lösning tas 10 och 20µL. PROTEINBESTÄMNING enl. BRADFORD (M.M. Bradford, Anal. Biochem. (1976) 72, ). Proteinreagens mg Coomassie Brilliant Blue G-250 löst i 50 ml 95% EtOH 2. Tillsätt 100 ml 85% (w/v) H 3 P Blandningen spädes till 1l Slutkonc: 0.01% (w/v) Coomassie Brilliant Blue G % (w/v) EtOH 8.5% (w/v) H 3 P0 4 Makrometoden (dvs µg prov) Proteinlösningar µg i en volym upp till 0.1 ml. Volymen justeras till 0.1 ml med vatten i alla rör. 5 ml proteinreagens tillsätts. Blanda. Mät vid λ = 595 nm efter 2 min men före 1 h i 3 ml kyvetter mot blank. Vid noggranna försök, mät inom intervallet 5-20 min efter proteinreagenstillsättning. Standardkonc: 0,1% (1 mg/ml) BSA. Mikrometoden (dvs 1-10 µg prov) Proteinlösningar 1-10 µg i en volym upp till 0.1 ml. Volymen justeras till 0.1 ml i alla rör. 1 ml proteinreagens tillsätts. Blanda. Mätning: likadant som makrometoden, men med 1 ml kyvetter. Standardkonc: 0.5 mg/ml. 30 (37)

31 Standard BSA görs i ordning i önskad koncentration som efteråt noggrant bestäms spektrofotometriskt. 0,1% BSA ska vid 280 nm ge en absorbans = 0,66. Kyvetter Kyvetten blir snabbt blåfärgad vid proteinmätning. Använd nya engångskyvetter (2st) som slängs efter användningen. Utförande Gör upp ett försöksprotokoll enligt nedan Namn Standard/ prov (µl) H 2 O (μl) Reagens (ml) Blank 0µg St 1 5µg St 2 10µg osv Prov I 10x spätt Pipettera i väl markerade rör först vatten därefter prov och sist reagens. Blanda väl. Avläs standard och provers absorbans mot blank vid 595 nm. Rita en standardkurva (millimeterpapper), där standardens absorbans avsätts mot dess proteinmängd i µg. Gå in på kurvan och avläs provernas proteinmängd, µg, och beräkna proteinkoncentrationen i µg/µl och därefter i mg/ml. Berräkna specifika aktiviteten i preparationen Beräkna även specifika aktiviteten från gradientcentrifugeringen (ni får värden både på aktivitetsmätning och proteinkoncentration) Vilken preparation är renast? 31 (37)

32 Dag 2 Gr3 (Gr3a och Gr3b) undervisar Gr1 respektive Gr2 Gr3a/Gr1 Börja med att gå igenom Förberedelser Visa (demonstrera) hur man: Väger och klipper en lever Homogeniserar, 20% homogenat slutvolym om leverbiten väger 8g? Tarerar Centrifugerar (varvtal, tid) Häller av Suspenderar Låt alla i Gr 1(2) få solubilisera mitokondrierna med DOC Gr3b/Gr2 Börja med att gå igenom Förberedelser Gr 2 får göra alla moment under Gradientcentrifugering Dag 1 Därefter får Gr3b/Gr2 byta med Gr3a/Gr1och göra ovanstående moment utom Förberedelser. Fortfarande med samma gruppindelning berättar grupp 3 hur: Enzymaktivitetsbestämningar gjordes Försöksprotokoll till proteinbestämning ska se ut (diskussion) Delar ut absorbansvärden för standard och prov Alla i Gr1 respektive Gr2 ritar och använder standardkurva för bestämning av proteinkoncentrationer 32 (37)

33 Alla beräknar specifika aktiviteten för malatdehydrogenas från differential- respektive gradientcentridugering med fiktiva värden. Alla diskuterar vilken centrifugeringsmetod som ger renast preparation och varför Dagen avslutas med att nya labgrupper konstrueras så att de nya grupperna har ungefär lika många experter från de här dagarnas laborationer inför projektet Rening och karakterisering av Karboanhydras, som alla praktiskt ska utföra. 33 (37)

34 Proteinseparation med Pharmacias simuleringsprogram. Pharmacias simuleringsprogram går ut på att man har en proteinblandning av 20 st enzymer som skall separeras. Man arbetar med ett i taget. Det är lämpligt att börja med en av de enklare för att se hur programmet fungerar. Programmet är ur datasynpunkt av en mycket enkel typ. Det är ej musstyrt och det går inte att gå fram och tillbaka hur som helst eller att ångra det man har gjort utan att följa de regler som gäller för programmet. All styrning av funktioner sker med mellanslagstangenten och ENTER-tangenten. Sifferval bekräftas också med ENTER-tangenen. Vill man spara resultatet när man är klar, måste man ange både enhet och katalog före filnamnet. Exempel:A:\PHARM\ENZ10. Med ovanstående namn kommer filen att sparas på disketten med namnet ENZ10 i katalogen PHARM. Övning med ett av de enklare enzymerna, nr 10. Separationen kan börja med med jonbytare. Q är anjonbytare och S är katjonbytare. Bestäm ett ph-värde och eluera med en saltgradient mellan 0 och 0,4 molar som första ansats. Se sfter var enzymet har eluerats. Man kan kontrollera resultatet med SDS-PAGE som ger upplysningar om renhet och molmassa. Den tvådimensionella PAGEn ger dessutom en anvisning om pi för proteinet. PAGE kan också ge upplysning om en topp har samma sammansättning i början som i slutet Gå vidare. Ändra ph och gradient tills resultatet blir bra eller gå vidare med gelfiltrering. Prova de olika geltyperna. Använd den gel som ger den bästa upplösningen På enzym 10 bör resultatet bli ett helt rent enzym. Det finns en ekonomisk faktor med också. Arbetar man för oekonomiskt med för många olika metoder eller om man kör om en analys flera gånger får man en kommentar om att läsa på metoderna bättre, sedan kommer man inte vidare utan måste börja om från början. Då du har renat enzym nr 10 fortsätter du med enzym nr 3 enligt övningen på jonbytare (sid 36). Du måste veta skillnaden mellan anjon- och katjonbytare och vad som händer då du ändrar ph vid en separation. Du måste också veta skillnaden mellan de olika typerna av geler vid gelfiltrering. Prova gärna olika alternativ. För molmassebestämning används SDS-PAGE och gelfiltrering med Sephacryl 200. Observera att de två metoderna måste stämma överens! Om de inte gör det måste man finna en förklaring. 34 (37)

35 Tänk på att föra noggranna anteckningar på vad du gör och vad resultatet blir. Det viktiga är att enzymet blir helt rent och att utbytet blir högt I nedanstående 2-dimensionella elfores finns alla(?) proteiner med molmassa(?) och pi. Vilken av dem är det du arbetar med? (?) ovan innebär att man måste tänka sig för! 35 (37)

36 Övning på jonbytare med simuleringsprogram Välj enzym 3. Det är stabilt vid 50 o ph 3,5-10,0 Välj Jonbytare Välj S-Sepharose (katjonbytare) ph=7,0 och Salteluering 0-0,4M Välj Assay for enzymactivity Välj Dilute fractions and reassay Vad har hänt med enzymet? Jämför enzymaktivitet med total mängd protein i toppen Har enzymet pi över eller under ph=7? Gör en endimensionell SDS på mittenfraktionen Hur många band? Gör en tvådimensionell SDS på mittenfraktionen. Bra resultat? Gå till REPEAT THIS STEP Jonbytare 2) Välj Q-Sepharose (anjonbytare) ph=7,0 och salteluering 0-0,4 M Välj Assay for enzym activity Jämför enzymaktivitet med total protein i toppen Har enzymet bundits till jonbytaren? Verkar metoden bra? (Motivera svaret) Gå till REPEAT THIS STEP Jonbytare 3) Välj Q-Sepharose ph=7,0 salteluering 0-1,0 M Vad händer när Du eluerar med den mer koncentrerade saltlösningen? Förklara. Gå till REPEAT THIS STEP Jonbytare 4) Välj Q-Sepharose ph=9,0 salteluering M Var befinner sig enzymet? Förklara Vad måste Du göra? Pröva. 36 (37)

37 Gå till REPEAT THIS STEP Jonbytare 5) Välj Q-sepharose ph=4,0 salteluering 0-0,4M Dilute fractions and reassay Är detta ph bra? ( motivera svaret ) Gå till REPEAT THIS STEP Jonbytare 6) Vilken jonbytare skall Du välja för bra separation? Vilket ph är bäst? Vilken saltgradient väljer Du? Pröva med den jonbytare vid det ph och med den saltgradient som Du valt Pool fractions Gör endimensionell SDS Gör tvådimensionell SDS Resultat? Resultat? Ange pi och molmassa för enzymet (om det är helt rent). Övningar på lite svårare separerationer: 1.Välj protein nr 2. Här får Du en topp med kromatografiska metoder men två fläckar med elektroforetiska metoder då Du har renat proteinet. Förklara varför. Hur stämmer molmassan från SDS-PAGE med att proteinet kommer ut mycket snabbt från en kolonn med Sephacryl S-200 HR? 2. Välj protein nr 13 eller 17. Bestäm molmassa och pi för ett av dessa proteiner. Ingen laborationsrapport lämnas in. Kunskaperna redovisas på tentamen. 37 (37)