Översikt metodprinciper Allmänkemianalyser. Carl-Eric Jacobson Klinisk kemi Sahlgrenska Universitetssjukhuset

Transkript

1 Översikt metodprinciper Allmänkemianalyser Carl-Eric Jacobson Klinisk kemi Sahlgrenska Universitetssjukhuset

2 Vi måste ha koll på vad vi mäter Viktigt att veta vid felsökning/konstiga resultat Viktigt att kunna vid frågor från kliniker Viktigt att veta om vi kan eliminera interferenser

3 Olika metodprinciper Jonselektiva elektroder (Direkt/Indirekt) Bestämmning av enzymaktivitet (ej konc.) Metoder där enzymer är en viktig del av analysprincipen ofta kallade enzymatiska Komplexbindningsmetoder Antikroppsbaserade metoder på allmänkemiinstrument Övriga metoder

4 Triglyceridmetod triglycerid + 3 H 2 O glycerol + ATP GK lipas glycerol + 3 FFA glycerol-3-fosfat + ADP glycerol-3-p + O GPO 2 dihydroxyacetonfosfat + H 2 O 2 H 2 O aminofenazon + 4-klorfenol peroxidas röd färg + 2H 2 O+HCl H H-C-O H-C-O- H-C-O- H Fritt glycerol normalt <0.2 mmol/l

5 Individ 1 Fysiskt frisk man 70 år gammal TG 4-11 mmol/l Behandlas för hyperlipidemi Diet, alkoholrestriktioner Statiner, nikotinsyra - ingen TG -sänkning Kraftiga biverkningar Lipidelfores - diagnos GKD

6 Urea Urea hydrolyseras av ureas och bildar ammoniak och karbonat. Ureas Urea + 2 H 2 O 2 NH CO 3 2- I den andra reaktionen reagerar 2-oxoglutarat med ammonium i närvaro av glutamatdehydrogenas (GLDH) och koenzymet NADH och bildar L-glutamat. I denna reaktion oxideras två mol NADH till NAD + för varje hydrolyserad ureamol. NH oxoglutarat + NADH GLDH L-glutamat + NAD + + H 2 O Hastigheten av minskning i NADH-koncentrationen står i direkt proportion till ureakoncentrationen i provet och mäts fotometriskt. Provtagningsrör med NH4-heparin skall undvikas

7 Bilirubin Total-bilirubin består av okonjugerat (indirekt reagerande), konjugerat (direktreagerande) samt delta-bilirubin. Det okonjugerade bilirubinet frigörs från albumin av en tensid. Sedan kopplas det totala bilirubinet med en diazoniumförening (DPD) och bildar motsvarande rödfärgade azobilirubin.

8 Direktreagerande (Konjugerat) Bilirubin Diazometoder för konjugerat bilrubin oftast mycket känsliga för hemolys. Nästa bild visar hemolys vid kapillär provtagning i hälen. (Clin Biochemistry 40 (2007)

9

10 Alltså viktigt att hitta en metod för konjugerat bilirubin som är mindre hemolyskänslig.

11 Siemens metod för konjugerat bilirubin Bilirubinet oxideras av vanadin med ph-värde på c:a 3 för att producera biliverdin. Oxidationsreaktionen minskar den optiska densiteten för den gula färg som är specifik för bilirubin. Minskningen i absobans vid 451 nm står i proportion till den totala bilirubinkoncentrationen i provet. Koncentrationen mäts som en endpointreaktion. Reaktionsekvation Konjugerat bilirubin VO3- biliverdin

12 Viktigt att våga ifrågasätta leverantörernas metoder Ovanstående exempel visar en metod som inte fungerar för den patientgrupp som nog de flesta proverna tas på

13 Bestämning av enzymaktivitet Det finns ingen kalibrator utan metoderna ställs mot en referensmetod där betingelserna är mycket väl definerade. Alltid instrumentspecifika modifieringar. Inteferenser

14 ALAT Denna analys följer rekommendationerna från IFCC, men optimerades för prestanda och stabilitet. ALAT katalyserar reaktionen mellan L-alanin och 2-oxoglutarat. Det pyruvat som bildats reduceras med NADH i en reaktion katalyserad av laktatdehydrogenas (LDH) för att bilda L-laktat och NAD +. Pyridoxalfosfat verkar som ett koenzym i aminotransferasreaktionen. Det säkerställer full enzymaktivering. L-Alanin + 2-oxoglutarat ALAT pyruvat + L-glutamat LDH Pyruvat + NADH + H + L-laktat + NAD + Graden av NADH-oxidering står i direkt proportion till den katalytiska ALAT- aktiviteten. Den bestäms genom att mäta ökningen i absorbans. Fundera på hemolyskänslighet ALAT ASAT

15

16

17 ALP I närvaron av magnesium- och zinkjoner klyvs p-nitrofenylfosfat av fosfataser och bildar fosfat och p-nitrofenol. ALP p-nitrofenylfosfat + H 2 O fosfat + p-nitrofenol Det p-nitrofenol som frisätts står i direkt proportion till den katalytiska ALP-aktiviteten. Den bestäms genom att mäta ökningen i absorbans vid 409 nm

18 Tillsatser i provtagningsrör kan påverka kemin i metoden och ge felaktiga resultat EDTA (antikoagulantia, koagulation kräver närvaro av Ca 2+ ) Bildar kelat med tvåvärda katjoner Ca 2+, Mg 2+, Zn 2+ : sänker deras nivå vilket förutom analys av nämnda joner även påverkar ALP-metoden.

19 Laktatdehydrogenas (LD) Aktivitetsbestämning Laktatdehydrogenas katalyserar omvandlingen av L-laktat till pyruvat; NAD + reduceras till NADH i processsen. LDH L-Laktat + NAD + pyruvat + NADH + H + Initiala hastigheten av NADPH-bildningen står i direkt proportion till den katalytiska LDHaktiviteten. Den bestäms genom att mäta ökningen i absorbans vid 340 nm. Analysen är mycket hemolyskänslig

20

21 Laktat Koncentrationsbestämning Enzymatisk kolorimetrisk metod. L-laktat oxideras till pyruvat med det specifika enzymet laktatoxidas (LOD). Peroxidas (POD) används för att skapa en färgning med hjälp av den väteperoxid som skapats i den första reaktionen. L-Laktat + O 2 pyruvat + H 2 O 2 POD 2 H 2 O 2 + H givare+ 4-AAP kromogen + 2 H 2 O Intensiteten på den bildade färgen står i direkt proportion till L-laktat-koncentrationen. Den bestäms genom att mäta ökningen i absorbans vid 552 nm. LOD

22

23 Metoder där enzymer används ofta kallade enzymatiska. Glukos Laktat Triglycerider Kolesterol Urea Urat m.fl.

24 Kreatinin - Jaffe Högt bilirubin: falskt lågt S-Kreatinin vid Jaffe- metod: Jaffe: Alkalisk miljö, Pikrinsyra (gul) + kreatinin kromogen (orange): mäts med spektrofotometri Bilirubin oxideras, bakgrundsabsorbansen i spektrofotometern sjunker.

25 Kreatinin enzymatiskt Enzymatisk kolorimetrisk kreatininmetod: Högre precision, Kreatininas - men minskar också av bilirubin kreatinin + H2O kreatin HI kreatinas kreatin + H2O sarkosin + urea SOD sarkosin + O2 + H2O glycin + HCHO + H2O2 POD H2O2 (= Väteperoxid) + 4-aminofenazon + HTIB kinoniminkromogen + H2O + H2O2 + Bilirub oxiderat Bilirubin + H2O Bilirubin konsumerar H2O2 total färgintensitet under reaktion minskar

26 Ultrafiltrering Filter med lämplig cutoff tar bort bilirubin bundet till albumin. För vilka analyter fungerar ultrafiltrering för att elimimera bilirubinteferens?

27

28 Etylenglykol (enzymatisk) Fotometrisk metod, slutpunktsmätning. Etylenglykol + NAD+ GDH Glykolaldehyd + NADH + H+ GDH = Glyceroldehydrogenas (EC ) NAD/NADH= Nikotinamidadenindinukleotid (oxiderad/reducerad) Absorbansökningen vid 340 nm beror på ökad NADHkoncentration som är proportionell mot koncentrationen av etylenglykol.

29 Etylenglykol (enzymatisk) utan inteferens av glycerol Fotometrisk metod, slutpunktsmätning. glycerol + ATP GK glycerol-3-fosfat + ADP Etylenglykol + NAD+ GDH Glykolaldehyd + NADH + H+ GDH = Glyceroldehydrogenas (EC ) NAD/NADH= Nikotinamidadenindinukleotid (oxiderad/reducerad) Absorbansökningen vid 340 nm beror på ökad NADH-koncentration som är proportionell mot koncentrationen av etylenglykol.

30