Kemiska metodprinciper inom allmänkemi samt vanliga felkällor. Sten-Erik Bäck Klinisk kemi Labmedicin Skåne

Transkript

1 Kemiska metodprinciper inom allmänkemi samt vanliga felkällor Sten-Erik Bäck Klinisk kemi Labmedicin Skåne

2 Analyser inom allmänkemi Beställs ofta Har kort analystid Analyseras utan föregående upparbetning (utfällning, extraktion etc.) Baseras på spektrofotometri eller jonselektiv mätning Analyseras på samma plattform Använder färdigköpta reagens Utförs i plasma/serum

3 Metodprinciper inom allmänkemi P-ALAT Enzym P-Koldioxid Enzymreagens P-ALP Enzym P-Kolesterol ER + Komplexbindning P-Ammonium Enzymreagens P-Kreatinin (enz) Enzymreagens P-Apolipoprotein A1 Immunturbidimetri P-Kreatinkinas (CK) Enzym P-Apolipoprotein B Immunturbidimetri P-LDL-kolesterol Enzymreagens P-ASAT Enzym S-LD Enzym P-Bilirubin, konj Komplexbindning P-Lipoprotein (a) Immunturbidimetri P-Bilirubin Komplexbindning S-Litium Komplexbindning P-Calcium Komplexbindning P-Magnesium Komplexbindning P-Digoxin Immunoassay Dv-Natrium Jonselektiv mätning P-Fosfat Komplexbindning P-Natrium Jonselektiv mätning S-Gallsyror Enzymreagens P-Pankreasamylas Enzym P-Glukos Enzymreagens P-Paracetamol Immunoassay (EMIT) P-GT Enzym P-Salicylat Enzymreagens P-HDL-kolesterol Enzymreagens P-TIBC Immunturbidimetri P-Järn Komplexbindning P-Triglycerider Enzymreagens Dv-Kalium Jonselektiv mätning P-Urat Enzymreagens P-Kalium Jonselektiv mätning U-Urat Enzymreagens Dv-Klorid Jonselektiv mätning P-Urea Enzymreagens P-Klorid Jonselektiv mätning P-Homocystein Enzymreagens

4 Metodprinciper inom allmänkemi P-ALAT Enzym P-Kolesterol Enzymregens P-ALP Enzym P-Digoxin Immunoassay P-ASAT Enzym P-Paracetamol Immunoassay (EMIT) P-GT Enzym P-Apolipoprotein A1 Immunturbidimetri P-Kreatinkinas (CK) Enzym P-Apolipoprotein B Immunturbidimetri S-LD Enzym P-TIBC Immunturbidimetri P-Pankreasamylas Enzym Lp(a) Immunturbidimetri P-Ammonium Enzymreagens Dv-Kalium Jonselektiv mätning S-Gallsyror Enzymreagens P-Kalium Jonselektiv mätning P-Glukos Enzymreagens Dv-Klorid Jonselektiv mätning P-HDL-kolesterol Enzymreagens P-Klorid Jonselektiv mätning P-Koldioxid Enzymreagens Dv-Natrium Jonselektiv mätning P-Kreatinin (enz) Enzymreagens P-Natrium Jonselektiv mätning P-LDL-kolesterol Enzymreagens P-Bilirubin, konj Komplexbindning P-Salicylat Enzymreagens P-Bilirubin Komplexbindning P-Triglycerider Enzymreagens P-Calcium Komplexbindning P-Urat Enzymreagens P-Fosfat Komplexbindning U-Urat Enzymreagens P-Järn Komplexbindning P-Urea Enzymreagens S-Litium Komplexbindning P-Homocystein Enzymreagens P-Magnesium Komplexbindning

5 Enzymbestämningsmetoder Enzymer används som markörsubstanser Goda analysegenskaper Känsliga Lätta att mäta Billiga

6 Princip: do your thing! Substrat Produkt Substrat i överskott Lämpliga reaktionsbetingelser i övrigt (ph, temperatur, coenzymer etc.) Ett signalsystem => Reaktionshastigheten = k x E a (µkat/l)

7 Ofta utnyttjat signalsystem NADP + + H+ + 2e - NADPH

8 Enzymbestämningsmetoder Mäter omvandlingen substrat produkt Betingelserna (ph, temperatur, cofaktorer etc.) avgör hastigheten Optimerade betingelser för mätning har definierats av IFCC Spårbarhet?

9 Enzymbestämningsmetoder - mer eller mindre komplexa Nitrofenylfosfat+ H 2 O Nitrofenol (gul) + fosfat (ALP) L-Laktat + NAD + Pyruvat + NADH + H + (LD) L-Alanin + 2-oxoglutarat pyruvat + L-glutamat (ALAT) Pyruvat + NADH + H + L-Laktat + NAD + (LD) L-Aspartat + 2-oxoglutarat oxalacetat + L-glutamat (ASAT) Oxalacetat + NADH + H + L-Malat + NAD + (MDH) Kreatinfosfat + ADP kreatin + ATP (CK) ATP + D-glukos ADP + G6P (HK) G6P + NADP + D-6-fosfoglukonat + NADPH + H + (G6PDH)

10 Enzymer som reagens Metoderna mäter substratkoncentration Hög specificitet för ett visst substrat eller en substratfamilj ex ureas, urikas, glukosoxidas eliminerar behovet av upparbetning minskar interferensrisken Kreatinin Urat Ammoniak Urea Glukos Laktat Triglycerider etc.

11 Kopplad reaktion för ökad specificitet Glukos + ATP ADP + glukos-6-fosfat (HK, ospec) Glukos-6-fosfat + NADP + 6-fosfoglukonat + NADPH + H + (G6PDH, spec för glukos)

12 Jfr CK-metoden Kreatinfosfat + ADP kreatin + ATP (CK) ATP + glukos ADP + G6P (HK) G6P + NADP + 6-fosfoglukonat + NADPH + H + (G6PDH) (Kreatinfosfat, ADP, glukos, NADP, HK, G6DPH i överskott)

13 Exempel: kreatinin Tidigare metod (Jaffe) komplexbindning med pikrat känslig för interferenser (glukos, protein, bilirubin, ketonkropper etc. etc.) många metodvarianter för att öka specificiteten

14 Trinderreaktionen Färgreaktion H aminofenazon + fenol -> kinoniminfärgämne Används i metoder för t ex Kreatinin Laktat Glukos Triglycerider Kolesterol HDL LDL Urat

15 Metoder som utnyttjar Trinderreaktionen Kolesterolester + H 2 O Kolesterol + RCOOH (kolesterolesteras) Kolesterol + O 2 Kolest-4-en-3-on + H 2 O 2 (kolesteroloxidas) Kreatinin + H 2 O Kreatin (kreatininas) Kreatin + H 2 O Sarkosin + Urea (kreatinas) Sarkosin + O 2 + H 2 O Glycin + HCHO + H 2 O 2 (sarkosinoxidas) Urat + 2 H 2 O + O 2 Allantoin + CO 2 + H 2 O 2 (urikas)

16

17 Komplexbindningsmetoder Användning av speciella bindarmolekyler som bildar färgade komplex med hög affinitet för analyten Pikrinsyra (Kreatinin) Diazoreagens (Bilirubin) BAPTA (Ca) FerroZine (Fe) CPZ-III (Mg) Traditionell klinisk kemi

18 Jonselektiva elektroder (ISE) Används för mätning av elektrolytkoncentrationer (eller -aktiviteter!) Elektrokemisk mätteknik Vanliga Na, K, (Cl) Med eller utan spädning av provet

19 Interferens Analytisk Interfererar i reaktionen Hög bakgrund Kompetitiv interferens Biologisk interferens Hemolys (inte Hb)

20 Vanliga interferenser Källa Hemolys Bilirubin Lipider Hur biologisk interferens via eryrocytkomponenter, spektral interferens (Hb), direkt interferens (Hb) hög bakgrund, direkt interferens, kompetitiv interferens ljusspridning, volymseffekter

21 Interferenser

22 Hb-interferens i konjugerat bilirubin

23

24 Interferenstestning Interferogram enligt Glick* Rekommendationer finns i CLSI-dokumentet EP7-A2. Interference testing in clinical chemistry (CLSI 2005). *Glick MR, Ryder KW, Jackson SA. Graphical comparisons of interferences in Clinical Chemistry Instrumentation. Clin Chem 32:470-5;1986

25 Lipidcentrifugering Centrifugering i > x g 10 minuter ALAT ALP ASAT Bilirubin Bilirubin, konjugerat Ca CK CKMB Fosfat Glukos GT Järn Kreatinin LD Natrium, Kalium, Klorid Pankreasamylas Urat Urea

26 Eliminerar bilirubininterferens i kreatininprover Ultrafiltrering

27 Elektrolyter i lipemiska prover mäter vi rätt? Patient i Kristianstad med L-index 1093 Obehandlat prov hade Na 114, K 4,0 Efter lipidcentrifugering Na 125, K 4,4 Från insert ISE:

28 Pseudohyponatremi Falskt lågt analysresultat beroende på hög halt av lipider eller protein Inträffar med metoder som mäter koncentrationen efter spädning av provet (t ex flamfotometri eller indirekt ISE (Cobas)) Direkt ISE (ABL) mäter rätt

29 Plasma innehåller normalt ca 93% vatten, i vilket elektrolyterna är lösta Resten utgörs av protein och lipider I extrema fall kan vattenandelen vara betydligt lägre

30 Vad händer när provet späds? Vid en spädning följer färre natriumjoner med i alikvoten till det nya röret ju högre lipidhalt i provet Spädningssteg Prov 1 före spädning Prov 2 före spädning Prov 1 efter spädning Prov 2 efter spädning

31 Direkt/indirekt ISE Direkt ISE (t ex ABL) påverkas ej av höga lipid- /proteinnivåer ABL mäter därför 7% högre elektrolyter i prover med normal lipid- och proteinhalt, men mätresultatet kompenseras för denna skillnad Perfekt korrelation för elektrolyter kan emellertid aldrig erhållas mellan direkta och indirekta ISEmätningar, eftersom kompensationen för 7% undanträngd volym bara är en genomsnittssiffra!