få se en naturvetenskaplig forskningsmiljö och träffa människorna i den miljön.

Transkript

1 Martin Andersson Kurs 3, Professionen Lärarutbildningen Malmö högskola NO-relaterat studiebesök Jag tänkte att mina gymnasieelever skulle få göra ett studiebesök på en universitetsavdelning som både bedriver forskning och grundutbildning, nämligen avdelningen för mikrobiologi på Institutionen för cell- och organismbiologi vid Lunds universitet. Naturvetenskapsprogrammet är ett studieförberedande program där de flesta elever kommer att läsa vidare på universitet och högskolor. Jag tycker därför att det är viktigt att de får en liten blick av vad som pågår ute på dessa institutioner. Jag tänker mig att detta studiebesök görs under gymnasiets sista år för elever som läser Biologi B och Kemi B. Jag tänker mig en mindre grupp elever som har valt fördjupning inom området biologi/bioteknik/biokemi. Mitt mål med studiebesöket är att eleverna ska: få se en naturvetenskaplig forskningsmiljö och träffa människorna i den miljön. få prova på någon av flera olika molekylärbiologiska/biokemiska tekniker som används i arbetet i kedjan från DNA till protein. göra en presentation av sin del av studiebesöket (efteråt i skolan) för att fläta samman studiebesöket med stoff både från biologi- och kemiundervisningen. Forskningen på mikrobiologiavdelningen berör reglering, funktion och transport av heminnehållande proteiner. Det mest kända hemproteinet måste vara människans hemoglobin. Hemoglobinet fungerar som syretransportör i vårt blod och det var där det upptäcktes först. Numera vet man att hem-proteiner finns i alla levande organismer, dvs djur, växter, svampar och bakterier. På mikrobiologiavdelningen arbetar man med bakterier för att försöka få reda på mer om hemproteinerna. Många bakterier har enorma förmågor att anpassa sig till en väldigt varierande livsmiljö. De måste exempelvis kunna leva i miljöer med oväxlande låg och hög syrehalt och de måste kunna tåla en mängd giftiga ämnen som bildas vid nedbrytningen av organiskt material.. Det är bl.a. i dessa processer som hemproteinerna gör sitt arbete. För att snabbt kunna anpassa sig efter den rådande miljön måste bakterierna snabbt känna av vad som finns i omgivningen. I människan finns fler hemproteiner än hemoglobin. I levern finns en mängd hemproteiner som ansvarar för nedbrytningen av giftiga substanser i vår kropp. Dessa hemproteiner oxiderar de skadliga ämnena och göra dem mer vattenlösliga så vi kan utsöndra dem med urinen. De oskadliggjorda substanserna skulle annars bl.a. kunna orsaka mutationer som kan ge upphov till cancer. Forskningen kring hemproteiner i bakterier kan alltså också ge oss kunskaper om hur vår egen kropp fungerar På mikrobiologiavdelningen studeras bland annat funktionen och regleringen av trunkerat hemoglobin (TrHb), en kortare variant av hemoglobin. När man slår ut genen

2 för TrHb blir bakterierna mycket känsligare för giftiga kväveföreningar, t.ex. NO. Det är framställning av detta protein jag tänkte att eleverna skulle få jobba med. Genom att välja något man aktivt arbetar med på avdelningen, så finns allt materiel lättillgängligt vilket underlättar studiebesöket. Förberedelsearbete med eleverna i skolan. I skolan kommer eleverna i biologi- och kemiundervisningen att studera organismvärlden med molekylära infallsvinklar respektive molekyler med biologisk anknytning. Det handlar om uppbyggnad och funktion hos nukleinsyror och proteiner, metabolism, genetik, genreglering och genteknik. Helst skulle jag vilja se en samkörning av biologi- och kemilektioner för att ge en enhetlig bild. Förhoppningsvis kan detta studiebesök ge eleverna känsla för att kemi och biologi inte är två helt skilda discipliner utan att de flyter in i varandra. Innan studiebesöket tänker jag att presentera de olika delarna i studiebesöket. Jag tänkte dela upp eleverna i fyra grupper om 3-4 personer som ska få jobba ihop under besöket. De fyra grupperna ska göra följande: 1. Tillverka genmodifierade bakterier genom att föra in genen för TrHb på en plasmid i Escherichia coli. 2. Välja ut bakteriekolonier och odla upp en stor sats från dessa. 3. Skörda bakterieodling och behandla bakterierna för vidare analys. 4. Undersöka TrHb-innehållet i ett cellextrakt med gelelektrofores och proteininfärgning. Bakgrund Den teoretiska bakgrunden kommer eleverna ha gått igenom under lektionerna. Vid arbete med att föra in gener i nya celler används plasmider, som är ringslutet extrakromosomalt DNA. I plasmiden klistrar man i den gen man vill föra in i bakterien. Genom att utsätta bakterier för en elektrisk stöt kan man få deras cellmembran att tillfälligt gå sönder, och därigenom möjliggöra direkt upptag av en plasmid in i bakteriecellen. När man lägger spänning på en suspension av bakterier i närvaro av plasmid-dna är det dock långt ifrån alla bakterier som får in plasmiden. För att kunna plocka ut de bakterier som har fått in plasmiden finns på plasmiden en gen för resistens mot något antibiotikum, exempelvis ampicillin. Om man odlar de elektroporerade bakterierna i närvaro av ampicillin kommer endast de bakterier som står emot ampicillin att överleva. Dessa bakterier är de som har fått in den plasmid som vi ville ha in. Man säger att man odlar bakterierna i ett selektivt medium - man väljer alltså ut de bakterier som klarar av att stå emot ett visst antibiotikum. I dessa sammanhang vill man oftast kunna kontrollera bakteriernas produktion av det protein vi är intresserade av. I vårt fall används den absolut mest kända regleringsmekanismen av alla, lac-operatorn. Det är mekanismen för reglering av laktosnedbrytning hos E. coli. I naturliga sammanhang styr tillgången på laktos hur mycket laktosnedbrytande enzymer E. coli tillverkar. I molekylärbiologiska sammanhang har man tagit bort generna för laktosnedbrytande enzymer och har bara kvar regleringsmekanismen. På de borttagna genernas plats kan man sätta in den gen man är intresserad av och kontrollera dess uttryck. Man skulle kunna styra detta med laktos, men laktos bryts ju ned av cellerna, så istället reglerar man genuttrycket med ett ämne som inte bryts ned, IPTG (isopropyl-β-d-tiogalaktopyranosid). Med detta ämne kan man

3 styra uttrycket av den gen man har satt in i plasmiden. I vårt fall styr vi uttrycket av genen för TrHb. När man har elektroporerat bakterierna sprider man ut dem på en odlingsplatta som innehåller ampicillin, IPTG och näring för bakterierna. Bakterierna får växa till sig i värmeskåp över natten och dagen efter kan man se små kolonier av bakterier som i vårt fall är rödfärgade av proteinet TrHb som vi har fört in genen för. Redan på detta stadium kan vi se på bakteriekolonierna att något har hänt när vi stoppade in en gen utifrån. Nu är det dags att plocka en koloni som är röd och odla upp denna i stor skala för att kunna få ut mycket protein, vilket man ofta är intresserad av. En bakteriekoloni man plockar härstammar från en enda bakterie som har delat sig väldigt många gånger. För att odla upp bakterier plockar man en koloni från plattan och slammar upp den i näringsmedium. Detta odlar man i stora glaskolvar under omrörning och värme så att bakterierna får luft och växer så bra som möjligt. Näringsmedlet måste innehålla ampicillin för att inte andra bakterier ska växa i kulturen. Våra önskade bakterier växer dock eftersom de har resistens mot ampicillin på plasmiden. Odlingen pågår i allt från ett par timmar till nästan ett dygn, beroende på hur snabbt bakterierna växer. Under odlingens gång följer man hur bakterierna växer till genom att mäta ljusspridning hos bakteriekulturen vid 600 nm, s.k. OD 600. Ett högt värde på OD 600 innebär att det är en hög bakteriehalt i odlingen. När bakteriekulturen har växt till sig tillräckligt är det dags att skörda bakterierna. Detta görs genom att man för över bakteriekulturen till flaskor som man kan centrifugera. I en centrifug låter man bakterierna sedimentera på botten av flaskorna till en pellet. Försiktigt kan man nu hälla av odlingsmediet och få bakteriepelleten kvar. Pelletar från alla centrifugflaskor samlas ihop och slammas upp i lite buffertlösning. Nu är det dags att ta sönder cellerna så att vi kan få ut proteinet. Detta gör man genom att pressa sönder bakterierna i en s.k. French Press. Med högt tryck pressar man bakteriesuspensionen genom ett så litet hål att bakterierna måste gå sönder för kunna passera. Därefter tar man de sönderslagna cellerna och centrifugerar ned cellväggsresterna. I supernatanten (lösningen ovanför pelleten) finns nu en mängd vattenlösliga proteiner och andra vatttenlösliga substanser från cellerna. Denna supernatant samlas nu upp och är färdig för upprening och analys. Ett sätt att separera proteiner är att använda gelelektrofores. Detta är en storleksseparation, där stora proteiner vandrar långsammare genom ett nätverk av polyakrylamid. Först kokas proteinprovet i ett par minuter med natriumdodekylsulfat (SDS), en vanlig ingrediens i tvål. Det gör att proteiner denatureras, vecklar ut sig och blir negativt laddade. Provlösningen appliceras på polyakrylamidgelen, varefter man lägger på en spänning. De negativt laddade proteinerna kommer nu att dras mot pluspolen. Beroende på storlek så kommer nu proteinerna att vandra olika snabbt.. När man slår av strömmen stannar proteinerna och man kan göra en infärgning av proteinerna. Det görs med ett färgämne som kallas Coomassie Brilliant Blue vilket blåfärgar alla proteiner. Känner man nu storleken på ett protein, så kan man identifiera olika proteiner i en blandning genom att man ser olika blå band som har vandrat olika långt. Förberedelser Detta studiebesök kräver en del förberedelse, men jag tycker att det är värt det jobbet. Eftersom eleverna samtidigt ska få utföra olika steg i en kedja som egentligen tar 3-4 dygn beroende på de långa odlingstider, måste de olika stegen förberedas. Eftersom avdelningen regelbundet jobbar med dessa olika bakteriekulturer, så är det enkelt att

4 någon gång göra en extra odling av det man håller på med och sedan frysa in. En bakterieodling kan frysas in innan den skördas, vilket gör att detta kan göras i god tid innan. Samma sak gäller för ett cellysat som ska köras på SDS-PAGE. Det so mkrävs är god framförhållning. Det som egentligen behöver förberedas en eller två dagar innan är elektroporering och utspridning av bakterier med TrHb-plasmiden på agarplattor med IPTG och ampicillin för att få kolonier att sätta igång storodling ifrån. På plats Avdelningen för mikrobiologi har sina lokaler väldigt nära Universitetssjukhuset i Lund. I och med att nya Lundalänken byggdes, tillkom en busshållplats precis utanför huset vilket gör transporten dit mycket enkel. Tidåtgången jag tänker mig är en förmiddag eller eftermiddag, ca 4 timmar. Efter en kort välkomsthälsning av prefekt Einar Everitt delar eleverna upp sig i grupperna och traskar iväg till respektive plats. Läraren håller i en grupp medan de övriga grupperna handleds av var sin doktorand. Grupperna Grupp 1 har som uppgift att elektroporera och föra in plasmid-dna med genen för TrHb i elektrokompetenta E. coli-celler. De ska också föra in samma typ av plasmider, men som saknar genen för TrHb. Därefter tillsätts lite odlingsmedium, varefter bakteriekulturerna inkuberas en stund ca 30 min för att bakterierna ska återhämta sig från elchocken. Bakterierna sprids sedan ut på agarplattor med ampicillin och IPTG, varpå de ställs för övernattodling i 37 C. Grupp 2 har i uppgift att sätta igång odlingar av a) E. coli som har TrHb-plasmiden och b) E. coli som har plasmiden utan genen för TrHb. Det handfasta arbetet går ut på att inspektera de förberedda agarplattorna och välja kolonier med röd färg samt normalfärgade kolonier. Dessa kommer att befinna sig på olika agarplattor. För att påskynda den kommande odlingen kan samtliga kolonier från en platta skrapas och slammas upp i ampicillinförsett odlingsmedium. Allt detta odlas sedan i de mycket dyra bafflade glaskolvarna, som ger god syretillförsel vid odling på roterande skakbänk. Eleverna får sedan med jämna mellanrum mäta OD 600 och se hur bakterierna tillväxer och rita odlingkurvor. Grupp 3 får två förberedda upptinade suspensioner av E. coli som a) har TrHb-plasmiden och b) har plasmiden men utan genen för TrHb. De får centrifugera ned bakterierna i centrifugflaskor och sedan slamma upp bakteriepelletarna i buffertlösning. Därefter går de ned i källaren och tar sönder cellerna genom att köra dem genom French Press. Slutligen får de centrifugera ned cellväggar och -membran och samla upp den proteinrika supernatanten från båda bakterieodlingarna. Grupp 4 får använda två färdiga supernatanter från frysen. De får denaturera prover av de två olika supernatanterna med SDS. De får sedan applicera de denaturerade proverna på färdiga polyakrylamidgeler (finns färdiga att köpa) och köra elektroforesen. När gelen har gått färdigt färgas den in med Coomassie Brillant Blue. Efter avfärgning kommer de, om allt har gått rätt, att se skillnad mellan båda supernatanterna. TrHb har en molekylmassa på strax under 15 kda. Supernatanten från bakterierna med TrHb-plasmid visar därför upp ett kraftigt band vid 15 kda, medan detta band saknas i det andra lysatet. Efter torkning kan gelen tas med hem till skolan.

5 Samtliga grupper för noggranna anteckningar över vad de gör under laborerandet och dokumenterar gärna med digitalkamera. Biologiskt laborationsarbete är svårt att göra i skolan med elever eftersom det ofta krävs mycket tid. I dessa laborationer kommer det att bli en del väntetider. Dessa hoppas jag att eleverna kommer att utnyttja för att ställa frågor till sin handledare och kanske t.o.m. besöka någon av de andra grupperna. Efterarbete Tillbaka i skolan får eleverna arbeta med att förbereda presentationer kring sin egen del i studiebesöket, med översiktliga genomgångar av teknikerna de använt och vad som sker vid de olika stegen. Detta arbete kommer att kräva att eleverna kan ställa samman kunskaper från både cell/molekylärbiologi, fysik och biokemi och dessutom integrera dem till en bra helhet. Vid den sammanfattande presentationen kommer eleverna att få ut en kortfattad sammanfattning på vad de har gjort. Diskussion Detta studiebesök kan kanske snarare kallas en studielaboration. Jag tror dock att det kan vara bra att eleverna får prova på att laborera. Dels visar det att det mikrobiologiska arbetet inbegriper mycket laborerande. Dels tror jag att det är absolut nödvändigt att aktivera eleverna om man inte vill att de ska tappa intresset. Hur många studiebesök har man inte varit på där någon anställd har berättat och visat och berättat och visat vad de håller på med på arbetsplatsen. Det finns alltid de elever som har tusen frågor, men många bara hänger med och tänker på annat. Att aktivt få delta är både roligare och bättre ur lärandesynvinkel. Det är viktigt att elever får se sina produkter, vilket tyvärr inte blir fallet här eftersom alla jobbar med olika odlingar. Helst skulle man vilja att de fick göra allt i en ordningsföljd, men det är inte tidsmässigt möjligt. Man tvingas alltid göra kompromisser. Jag tror ändå att det ger eleverna en hel del att få se och prova på dessa moment, som är omöjliga att göra på skolorna eftersom utrustningen saknas. En sak jag tänker på är tidsåtgången. Jag hoppas att tiden är tillräcklig. Eleverna har ju trots allt en hel del labbvana från skolan, vilket är en förutsättning för att detta studiebesök ska fungera.