Humant papillomvirus som riskmarkör för utveckling av prolifererande verrukös leukoplaki

Transkript

1 Humant papillomvirus som riskmarkör för utveckling av prolifererande verrukös leukoplaki Angelica Gustavsson och Josefine Hjalmarsson Handledare: Gunnar Warfvinge Pia Lindberg Avdelningen för Oral Patologi Examensarbete (30 hp) Tandläkarprogrammet Februari 2013 Malmö högskola Odontologiska fakulteten Malmö

2 Abstract Proliferative verrucous leukoplakia, PVL, is a rare disease that is characterized by multiple and recurrent white lesions in the oral epithelium which over time may develop into cancer. The diagnosis can only be made by the clinician when the disease has progressed for a long time. There is no effective treatment. The etiology of the disease is unknown but today it is known that there is a link between cancer and certain viruses. The purpose of this study is to investigate whether it is possible to detect human papilloma virus, HPV, in tissue samples from patients who possibly are affected by PVL. The selected samples consisted of 11 cases in which tissue samples from the biobank at the Department of Oral Pathology at Malmö University, were collected and HPV was detected by chromogenic in situ hybridization. The results showed a higher incidence of HPV in biopsies taken at a later stage of the disease compared with previous biopsies. However, a specific HPV genotype could not be identified. In this study, it has not been possible to demonstrate HPV with in situ hybridization at an early state of PVL as a putative indicator of disease development 2

3 Sammanfattning Prolifererande verrukös leukoplaki, PVL, är en ovanlig sjukdom som yttrar sig genom multipla, vita förändringar i munslemhinnan som recidiverar och med tiden riskerar att utvecklas till cancer. Diagnosen kan endast ställas kliniskt när sjukdomsförloppet pågått under lång tid och det finns heller inga effektiva behandlingsmetoder. Etiologin till sjukdomen är okänd, men idag vet man att det finns ett samband mellan cancerutveckling och vissa virustyper. Syftet med studien är att undersöka om det går att påvisa humant papillom virus, HPV, i vävnadsprover från patienter som kan misstänkas ha PVL. Urvalet bestod av 11 patientfall, där vävnadsprover från biobanken vid avdelningen för oral patologi, Malmö högskola, samlats in och studerats med kromogen in situ hybridisering. Resultaten visade en högre förekomst av HPV i biopsier tagna i det senare skedet av sjukdomen jämfört med tidigare biopsier. En specifik HPV-genotyp kunde dock inte identifieras. I denna studie har det inte varit möjligt att påvisa HPV med in situ hybridisering, i ett tidigt stadium av PVL, som en möjlig indikator på sjukdomsutveckling. MeSH- termer: Human papillomavirus, in-situ hybridization, leukoplakia, neoplasms, oral, proliferative verrucous leukoplakia 3

4 Introduktion 1985 publicerade Hansen et al den första artikeln som rapporterar om en ovanlig form av leukoplaki som beskrivs som multifokal, långsamt växande, progredierande, terapiresistent med benägenhet att recidivera efter avlägsnande (1). Författarna valde att benämna detta tillstånd som prolifererande verrucös leukoplaki (PVL). PVL är en tydlig klinisk form av leukoplaki som definieras av sitt progressiva förlopp och som histologiskt primärt yttrar sig som enkla benigna hyperkeratoser men som med tiden progredierar till multifokala lesioner som ofta utvecklas till verrukös cancer eller skivepitelcancer (Figur 1a-c). Vid multifokal sjukdom befinner sig inte alla läsioner i samma stadium (2). Flera studier har gjorts för att identifiera en säker markör för när en lesion är en del av en PVL och när det föreligger en risk för cancerutveckling. Sambandet mellan PVL och COX-2, TGF-α och HPV har undersökts men ingen studie har nått övertygande resultat (2). Bruk av tobak och alkohol är de starkaste riskfaktorerna för utvecklandet av oral cancer men i fall med PVL har man inte sett något sådant samband(1,3). Etiologin är således okänd och tillsammans med ett brett spektrum i hur PVL yttrar sig till en början, kliniskt såväl som histologiskt, är det omöjligt att i ett tidigt skede avgöra om en första lesion, i form av en hyperkeratos, är del i en PVL (1). I sin studie illustrerar Hansen et al (1) hur en från början benign lesion utvecklas till en dysplastisk, precancerös förändring för att slutligen bli cancer. I Figur 2 framgår tydligt hur alla stegen i PVL-progressionen kan vara en differentialdiagnos och vice versa. Det man idag konstaterat om sjukdomen är att den drabbar kvinnor fyra gånger oftare än män, debutmedelåldern då diagnosen ställs för första gången är 66 år och från diagnostillfälle till utvecklandet av cancer tar det 4,4-11,6 år (2). Prolifererande verrucös leukoplaki är en ovanlig 4

5 klinisk diagnos som är svår att ställa i ett tidigt stadium då kriterierna för diagnosen idag bland annat innebär recidiv och terapiresistens. Idag vet man att det finns ett samband mellan cancerutveckling och vissa virustyper. Histologiskt ger PVL med sitt verrucösa epitel en bild som för tankarna till en vävnad infekterad med humant papillomvirus (HPV). Redan 1933, då viruset för första gången isolerades ur kaniner, rapporterades ett samband mellan HPV och malign transformation av benigna papillom (4). Syrjanen et al var de första att 1983 föreslå sambandet mellan HPV och orala lesioner efter att ha upptäckt virusindicerade koilocyter i orala lesioner (5). Detta bekräftades i uppföljande analyser av vävnaderna med in situ hybridisering där HPV hittades i fyra av fem leukoplakier och tre av sex cancerfall (5). Det faktum att HPV detekterats i benigna lesioner indikerar att inte alla typer av HPV-infektioner orsakar sjukdom och det vore av essentiellt värde att identifiera faktorerna som leder till malign utveckling. Sambandet mellan högrisktyperna 16 och 18 är idag accepterad som en av de viktigaste faktorerna bakom utveckling av livmoderhalscancer (6). Ett eventuellt samband mellan HPV och cancer i munhålan har rapporterats, men är inte lika väletablerat (7,8). HPV är ett för människan artspecifikt virus som tillhör familjen papillomaviridae. Papillomvirus är små DNA-virus som orsakar hud- och slemhinnehyperplasier. Enligt gällande uppfattning kan HPV inte infektera frisk hud eller slemhinna, infektion är endast möjlig om slemhinnan är penetrerad (9). Målet är de basala epitelcellerna där HPV behöver specifika receptorprotein på keratinocyternas cellmembran att binda till. När det väl har penetrerat cellmembranet, gör det sig av med sitt proteinhölje och virus-dna kan börja använda sig av värdcellen. HPV-genomet innehåller sex tidiga (E), två sena (L) gener och en lång kontrollregion (LCR) (9). Det är de tidiga generna, 5

6 E-generna, som initialt ökar celldelning och DNA-syntesen och stör faktorer som reglerar celldelningen och därmed möjliggör en signifikant replikation av virusgenomet (10). De flesta HPV-infektioner läker ut spontant, men blir de kroniska ökar risken för virusinducerade cellförändringar (9). De onkogena proteinerna E6 och E7 kontrolleras normalt av E1 och E2, men dessa kan raderas eller förändras vid virusintegrationen med okontrollerad transkription av E6 och E7 som resultat. De infekterade generna får en tillväxtfördel då E6 binder till p53, ett protein som normalt reglerar celldelningen, och E7 binder till proteinet Rb som även detta, normalt sätt, har en hämmande effekt på cellcykeln (7). (Figur 3) Den tumörsuppressiva funktion som p53 och Rb ansvarar för hämmas och cellerna får en högre benägenhet att ta sig igenom kontrollsystem trots skadliga mutationer (8). Genomet blir alltmer instabilt ju fler delningar det går igenom, mutationer ackumuleras och till slut förvandlas de till odödliga celler. Beroende på värdens respons kan detta leda till tumörbildning (11,12) hade över 150 olika typer av HPV identifierats (11). Typerna har namngetts i den ordning de identifierats och indelningen bygger på variationer i nukleinsyror i L1-genen. Virustyperna kan även klassificeras på andra sätt; bland annat baserat på beteende kan de indelas i hög- eller lågrisktyper. Tidigare har studier gjorts för att utreda om ett samband kan ses mellan PVL och förekomst av HPV. En studie påvisade en lika hög förekomst av HPV hos PVL-patienter (24,1%), som hos kontrollgruppen med orala leukoplakier (25,5%), och ingen signifikant skillnad på genotyp (13). En annan studie visade ingen förekomst av HPV hos 13 PVL-diagnostiserade patienter (14). HPV-16 har rapporterats vara den mest prevalenta typen i leukoplakier och i PVL (15), medan andra studier indikerar att lågrisktyper förekommer mest i leukoplakier (15) och ytterligare andra 6

7 talar om en koinfektion med flera olika typer av HPV (15). I metaanalysen av Miller och Johnstone (16) påstås att sannolikheten att detektera HPV i precancerösa läsioner är 2-3 gånger högre och i oral skivepitelcancer är den 4-5 gånger högre än i frisk slemhinna. I sin metaanalys kom de fram till följande prevalenser: 10% i normal mukosa, 20,2% i icke-dysplastiska leukoplakier, 26,2% i dysplastiska leukoplakier och andra precanerösa lesioner och 46,5 % i oral skivepitelcancer (16). Det är alltså sannolikt att det även finns ett samband mellan HPV och PVL. Syftet med vår studie är att utreda om det retrospektivt med hjälp av in situ hybridisering går att påvisa tidig förekomst av HPV i vävnadsprover från patienter med en möjlig PVL-diagnos för att på så sätt söka ett samband mellan utvecklingen av PVL och HPV förekomst. Material och metod Urval Patienterna som inkluderats i studien valdes ut från biobanken på Malmö högskolas avdelning för oral patologi. Då PVL inte är en histopatologisk diagnos, finns den inte registrerad i patientregistret och kan inte användas som sökord i patientdatabasen. Vissa remisser kan dock innehålla en fritextkommentar om möjlig PVL. Sökningen i patientdatabasen, som utfördes , genomfördes därför enligt följande: - Patientregistret genomsöktes med avseende på samtliga patienter med någon av följande diagnoser under 2000-talet; verrukös cancer, skivepitelcancer och möjlig diagnos PVL. Valet av verrukös och skivepitelcancer beror på att sjukdomsbilden vid PVL slutligen leder till någon form av cancer. 7

8 Sökningen resulterade i 2 patienter med PVL som kommentar, 20 patienter med diagnosen verrukös cancer och 307 med skivepitelcancer. Patientunderlaget granskades och för att inkluderas måste patienten förutom en cancerdiagnos uppvisa följande: 1. Andra diagnoser som kan förknippas med PVL, dvs benign hyperkeratos, lichenoid förändring, epiteldysplasi eller verrucös hyperplasi. 2. Materialet ska innefatta minst fyra remisser. 3. Biopsierna ska härstamma från minst två olika områden i munhålan. 4. Minst ett av dessa två områden ska ha utvecklat minst två olika lesioner relaterade till PVL, varav en ska vara cancer. Detta för att i studien kunna följa utvecklingen i ett område hos en PVL-patient och se hur HPV låter sig detekteras under sjukdomsförloppet från en benign eller precancerös lesion till cancer. 5. Senaste biopsin ska ha inkommit mellan och Detta av administrativa skäl, samt för att garanterat kunna få tillgång till biopsierna. Denna urvalsprocess resulterade i 10 patienter som uppfyllde kriterierna. Ytterligare två patienter inkluderades från patientdatabasen då de erhållit PVL som tentativ diagnos. I dessa två fall gjordes undantag med avseende på antalet remisser. Detta gav oss ett totalt patientunderlag på 12 patienter. Vid insamlandet av biopsierna föll en utvald patient bort då den biopsi som diagnostiserats med cancer saknades i biobanken, så det slutliga urvalet blev 11 patienter. Patienterna har i samband med biopsitagning lämnat samtycke till studier av de lämnade biopsierna. 8

9 In situ hybridisering In situ hybridisering är en histologisk metod som används för att detektera en speciell RNA- eller DNA-sekvens i en vävnad. Man kan med denna metod till exempel visa i vilka celler en viss gen används eller vilka celler som är infekterade med ett bestämt virus (17). Metoden bygger på att märkta DNA-prober bildar hybridmolekyler med eftersökta DNA-sekvenser i ett vävnadsprov, så kallad hybridisering. Förutsättning för detta är att proben och den eftersökta DNA-sekvensen är komplementära till varandra, samt att vävnadens DNA är åtkomligt för DNA-proben. Målet är att de eftersökta DNA-sekvenserna ska visualiseras så att det blir möjligt att granska vävnaden och dess innehåll under ljusmikroskop. In situ hybridisering kan delas in i tre arbetssteg. Steg ett är en förbehandling då proverna avparaffineras, rehyderas och genomgår en proteolytisk behandling. I andra steget sker denaturering och hybridisering. Efterbehandlingen innebär att de bildade hybridmolekylerna synliggörs till exempel via immunfärgning. De vävnadsprover vi studerat härrör från en biobank där proverna är inbäddade i paraffin. Inbäddningen i paraffin är en konserverande behandling för att vävnadsprover ska kunna bevaras och hållas stabila under lång tid. Efter att vävnadsvätskan ersättas av formalin måste de urvattnas, för att sedan bäddas in i paraffin. För att möjliggöra vidare studier på vävnadssnitt måste en avparaffinering utföras. Detta sker i xylen, följt av rehydrering i tre olika etanolbad med fallande alkoholkoncentration från 100% till 70%. Vid en in situ hybridisering måste vävnadens DNA vara åtkomligt för DNA-proben. Snitten behandlas därför enzymatiskt med en pepsinlösning (ES1), för att proteolytiskt bryta ned de proteiner i cellen som omger DNA, och därefter med en EDTA-lösning (etylendiamintetraättiksyra) 9

10 som tar bort de magnesiumjoner som behövs för att bevara cellmembranets struktur. Dessutom hämmas de enzymer i cellen som annars bryter ner DNA. Denna förbehandling av snitten resulterar i att DNA blottas. I nästa steg tillsätts en DNA-probe som är komplementär till den eftersökta DNA-sekvensen och markerad med en viss markör, ofta biotin eller digoxigenin. För att DNA-proben och den eftersökta DNA-sekvensen ska kunna binda till varandra måste cellens DNA delas, dvs denatureras. Denatureringen sker på värmeplatta så att vätebryggorna som håller ihop DNA-dubbelhelixen bryts. Enkla DNA-strängar kvarstår. Hybridiseringen sker i en efterföljande inkubering då DNAproben, via basparning, binder in till sin komplementära sekvens på de enkla DNA-strängarna. Hybridmolekyler bildas. Hybridmolekylerna synliggörs via immunfärgning där en primär omärkt antikropp (AB1) binder till hybridmolekylen via markören på DNA-proben, t.ex digoxigenin. En sekundär antikropp (AB2) som är märkt med ett enzym, binder till den primära antikroppen. Enzymet på den sekundära antikroppen, oftast peroxidas, bildar vid tillsats av ett substrat (AEC, 3-amino-9- ethylcarbazole), ett färgkomplex som kan visualiseras i ljusmikroskop (18). Ett positivt resultat visar sig som rött färgade kärnor som bäst undersöks i ljusmikroskop med gångers förstoring. Den omgivande vävnaden i proverna färgas med en annan färglösning (CS2) i en så kallad kontrastfärgning för att man enkelt ska kunna särskilja hybridiserade områden ifrån resterande vävnad. 10

11 I denna studie detekterades HPV i utvalda biopsier med kromogen in situ hybridisering (CISH) med ett detekteringskit (ZytoFastPlus CISH Implementation Kit HRP-AEC, ZytoVision GmbH, Bremerhaven, Tyskland). Detta kit är speciellt designat för att detektera digoxigeninmärkta DNA-prober i formalinfixerade och paraffininbäddade vävnads- eller cellprover (18). I kitet ingår en digoxigenin-markerad HPV-screening probe för HPV-typerna 6, 11, 16, 18, 31, 33, 35, 45, 51 och 82, två specifika prober för detektion av HPV-typerna 6/11 respektive 16/18, samt en positiv och en negativ kontrollprobe. Kontrollproberna består av oligonukleotider där den positiva, ZytoFastDNA(+)Control Probe (PF32), är komplementär till repetitiva Alu-sekvenser som alltid finns i mänsklig vävnad och den negativa, ZytoFastDNA (-)Control Probe (PF24), inte har samstämmighet med någon känd naturlig sekvens. Detta betyder att den positiva kontrollproben alltid och den negativa aldrig ska kunna visa utslag. I det fall de gör det, måste felkällor identifieras. Fabrikantens protokoll följdes med viss modifikation av temperaturer och arbetstider för att optimera metoden på äldre biopsier, även detta inom ramen för fabrikantens anvisningar. Metod Inledningsvis testades metoden för sin specificitet och sensitivitet på bifogade testprover med positiva resultat. De utvalda biopsierna som påvisats med cancer testades först med screeningproben. De vävnadsprover som visade positivt resultat vid screeningen, följdes upp med proben för HPV 16/18. Vid negativt utslag för HPV 16/18 utfördes en tredje inkubering med HPV 6/11-specifik probe. Om en patients cancerbiopsi visat sig positiv vid screening för HPV, utfördes även färgning av den tidigare biopsin från samma område. Denna biopsi hade en diagnos förenlig med PVL, men 11

12 tidigare i sjukdomsförloppet. Syftet var att följa utvecklingen av HPV-infektionen hos en PVLpatient under sjukdomsutvecklingen från en benign eller precancerös lesion till cancer. Kontrollfärgningar utfördes på samtliga cancerbiopsier, med både positiv och negativ kontroll (Figur 4). Metodbeskrivning Förbehandling med avparaffinering, rehydrering och proteolys: De paraffininbäddade biopsierna snittades till 4 µm och torkades på objektglas 4 timmar i 63 o C. Snitten avparaffinerades i xylen (3x7 minuter) och rehydrerades sedan i etanol (3x3 minuter). En inkubering i 10 minuter i 3% H 2 O 2 samt två minuter i destillerat vatten följde. Proteolysen genomfördes med pepsinlösning (ES1) 15 minuter i 37 o C i fuktkammare och efterföljdes av inkubering i 95 o C EDTA-lösning (PT2) i 15 minuter. DNA-denaturering och hybridisering Till varje snitt tillsattes 10 µl 37 o C varm DNA-prob med och täckglas fixerades över snitten med RubberCement, följt av en denaturering på värmeplatta med 75 o C i 5 minuter. Sedan följde hybridisering i fuktkammare i 37 o C under 20 timmar. DNA-detektion Täckglasen avlägsnades och snitten inkuberades först i 37 o C TBS-buffert i 5 minuter, sedan i rumstempererad TBS-buffert i 5 minuter. Mus-anti-DIG-antikropp (AB1) tillsattes droppvis och följdes av inkubering i fuktkammare under 30 minuter i 37 o C och därefter i rumstempererad TBS-buffert i 5 minuter. Anti-mus-HRP-polymer (AB2) tillsattes droppvis och inkuberades även 12

13 denna i fuktkammare under 30 minuter i 37 o C och i rumstempererad TBS-buffert i 5 minuter. AEC-färglösning (SB5) tillsattes droppvis och efterföljdes av en inkubering i fuktkammare under 25 minuter i rumstemperatur. Glasen tvättades i 2 minuter i destillerat vatten. Nuclear Blue Solution (CS2) tillsattes droppvis och inkuberades 7 minuter i rumstemperatur. Glasen tvättades under svagt rinnande vatten under 2 minuter och sköljdes därefter i destillerat vatten. Täckglas monterades med Mounting Solution (MT5) och lämnades för torkning i 30 minuter. Resultat De mikroskopiska fynden har sammanställts i Tabell 1. Av cancerbiopsierna var sex av nio positiva för HPV vid infärgning med screeningproben (Fig. 5). Tre av dem hade en föregående lesion som också var positiv vid screening (Fig. 6). En av patienterna med en cancer som var positiv vid screening och hade en positiv föregångare, uppvisade HPV 16/18 i cancern, dock inte i föregångaren (Fig. 7). Tre av patienterna uppvisade ingen HPV vid screeningen och följdes därför inte upp med fler infärgningar. De två patienter som tagits med i urvalet på grund av sin PVL-diagnos uppvisade inga tydliga resultat (Tabell 1: patient nr 4 och 8). En av patienterna uppvisade en positiv screening i båda lesionerna, medan den andra endast uppvisade det i en av lesionerna, i detta fallet i den tidigare tagna biopsin. Inga fall av positivitet för HPV-typ 6/11 hittades i materialet. 13

14 Diskussion Proliferativ verrukös leukoplaki (PVL) är en ovanlig sjukdom. Det är en klinisk diagnos som idag endast kan ställas retrospektivt. Detta är möjligt först när patienten nått ett slutstadium då sjukdomen tagit överhand. Med tanke på PVLs aggressiva förlopp och utmynnandet i recidiverande lesioner och cancer är det av stor betydelse för den enskilde individen som drabbas att etiologin klaras upp och att en diagnostisk metod tas fram så att diagnosen kan ställas i ett tidigare skede. HPVs betydelse för carcinogenesen har undersökts sedan 1930-talet och är än idag ett omdebatterat ämne. Ett samband mellan HPV och PVL har också föreslagits (19,20). I denna retrospektiva studie har biopsier från möjliga PVL-patienter undersökts med in situ hybridisering i syfte att utreda om möjlighet finns att detektera HPV, både på ett tidigt stadium i sjukdomsförloppet och i slutskedet, det vill säga när en cancer utvecklats. Resultaten visar inget tydligt samband mellan progressionen av PVL och infektion med HPV. I flera fall kan man påvisa HPV, dock förekommer det i större grad i biopsierna från det senare skedet av sjukdomen. Prevalensen av HPV i frisk oral slemhinna, premaligna lesioner och skivepitelcancer varierar stort och reviewartiklar rapporterar siffror mellan 0% och 100% (21). Svårigheten i att få fram den sanna rollen HPV spelar i carcinogenesen består både i bristande förståelse för hur HPV skulle kunna vara en orsakande faktor, men främst i begränsningen i att analysera och detektera HPV (22,8). HPV kan inte odlas in vitro och man är därför beroende av molekylära analyser av HPV-DNA (21). De olika detekteringsmetoderna och deras olika sensitivitet verkar vara den absolut viktigaste anledningen till den stora variationen i de rapporterade HPV-prevalenserna (7,8, 9, 21). 14

15 En bredspektrumsprob för HPV med en tydlig bild för positivt respektive negativt utfall skulle kunna leda till mer klarhet, både gällande orala lesioner såväl som lesioner i andra delar av kroppen. Metoden som valdes i denna studie var kromogen in situ hybridisering. Ett kit speciellt designat för detektering av digoxigenin-markerade DNA-prober i formalinfixerade och paraffininbäddade vävnads- eller cellprover användes. PCR är den metod som anses ha den högsta sensitiviteten för att detektera olika typer av HPV (23) där en virusförekomst på mindre än endast en kopia per cell är nödvändig (23) jämfört med in situ hybridisering som kräver en hög virusförekomst, kopior per cell (24). Alla molekylära analyser överskuggas av problemet med kontaminering mellan prover. DNA eller RNA kan lätt överföras mellan proverna via handskar, instrument eller till och med via luften. Trots noggrann isolering kan kontaminering inte alltid förhindras (22). Problemet med PCR är att det kan detektera en mycket liten mängd virus och även kontaminerade vävnader kan få positivt utslag. Positiva utslag med in situ hybridisering är mer säkra, då en större mängd virus krävs än vad som kan överföras via kontaminering. Det finns dock tekniska svårigheter med att tolka resultatet av in situ hybridisering. Om positiviteten är diffus uppstår inga problem, men ibland syns endast ett punktformat mönster av positiva signaler och då finns alltid risken att färgningen har skett ospecifikt (21). I de fall detta scenario har uppstått i denna studie har den negativa kontrollen av vävnadsprovet kontrollerats och om båda infärgningarna stämde överens med varandra drogs slutsatsen att det handlade om en ospecifik färgning och den punktformade färgningen har därmed bedömts som negativ. 15

16 Materialet till studien samlades in från biobanken på Malmö Högskolas avdelning för Oral patologi och består av patologiska vävnadsprover från patienter med ett flertal lesioner som ingår i sjukdomsbilden för PVL. Då PVL är en klinisk diagnos som yttrar sig i en sjukdomsbild med flera olika lesioner som slutligen leder till cancer kan den endast ställas retrospektivt av klinikern. I studien är den kliniska informationen begränsad till klinikerns remisstext då inga journalanteckningar inhämtats. För att på bästa sätt säkerställa att de patienter som tagits med i urvalet har diagnosen PVL användes stränga och snäva urvalskriterier. Utgångsmaterialet var mycket omfattande men på grund av urvalskriterierna valdes många möjliga PVL-patienter bort. Det finns därför förutsättningar för att i en senare, mera omfattande studie utvidga materialet genom att även inkludera journalanteckningar från klinikerna och därmed erhålla ett större urval av patienter. PVL progredierar under en mycket lång tid, vilket medför att en del av vävnadsproverna var upp till 13 år gamla. Trots inbäddning i paraffin, bryts DNA ned över tid, vilket kan innebära att utslaget av infärgningarna inte blir så tydligt som om vävnaderna hade varit färskare. Resultaten i studien visar en tendens till att HPV kan spela en roll i PVLs utveckling. I 7 av 11 patientfall kunde HPV detekteras i biopsin tagen i det senare sjukdomsskedet med hjälp av screeningproben. Vid uppföljningen av de sju fallen av en föregående biopsi från samma lokalisation var fyra positiva vid screening. I tre fall var vävnaden där cancer senare uppstod infekterad av HPV redan innan cancern uppstod, vilket antyder att HPV haft betydelse för den maligna transformationen. Fynden i de andra biopsierna som var positiva vid screening, men där HPV inte kunde följas tillbaka till innan cancern, tyder på att HPV i deras fall inte spelade in i carcinogenesen. Vid 16

17 livmoderscancer har man sett att HPV-infektionen avtar efter hand, vilket betyder att HPV skulle kunna initiera cancerstarten och sedan försvinna vilket antyder att denna tidiga effekt av HPV inte alltid kan upptäckas med traditionella molekylärbiologiska metoder. Det är heller inte klarlagt om HPV måste integreras i orala cellers genom för att påverka carcinogenesen eller om de kan förbli i episomal form (22). Möjligheten att en infektion med HPV kan avta eller helt försvinna efter att ha initierat den cancerogena transformationen innebär att det föreligger en brist i denna studie då inte alla biopsier från det tidiga stadiet genomgått screening för HPV. Endast i en biopsi i underlaget påvisades HPV 16/18 som anses vara de mest maligniserande HPV-typerna. HPV-16 har dock tidigare rapporterats som den mest prevalent typen i leukoplakier och i PVL (15). Inget fall med lågrisktyperna HPV 6/11 kunde identifieras trots att det har indikerats att lågrisktyper förekommer oftast i leukoplakier (16, 15). Detta kan bero på att den valda metoden med in situ hybridisering inte är tillräckligt känslig då ett visst antal viruskopior krävs för att ge ett positivt utslag. En del studier talar om en koinfektion med flera olika typer av HPV vilket stämmer väl över ens med resultaten i denna studie då flertalet positiva biopsier detekterades med screeningproben (15). Det har även föreslagits att HPV kan ha en initial roll i transformationen och sedan försvinna (15), något som inte stämmer med resultaten i denna studie då HPV påvisas mer frekvent i de senare lesionerna. Som nämnts tidigare har detta scenario dock inte utretts adekvat. En möjlig förklaring till skillnaden i studier skulle kunna vara att vissa cancerlesioner är sekundärinfekterade med HPV. Bagan et al har visat att PVL breder ut sig i form av så kallad field cancerization, vilket innebär att det över stora ytor förekommer spridda förstadier till cancer och invasiv cancer (14). Detta menar Bagan et al tillsammans med det korta tidsspannet mellan uppkomsten av lesionerna ger 17

18 stöd åt hypotesen att PVL har en infektiös etiologi, möjligen av viral typ (14). Bagan et al har dock misslyckats med att hitta HPV med PCR, sannolikt beroende på det begränsade urvalet, varför det inte går att dra några klara slutsatser. Då PVL är en ovanlig sjukdom, som är svår att diagnostisera, föreligger problem att utforma studier, där urvalet utgör ett tillräckligt underlag för att kunna komma fram till övertygande resultat. Den samlade bilden av dagens forskning är att HPV kan spela en roll i den maligna transformationen, framförallt med tanke på förmågan hos E6 och E7 att mediera cancer via inaktivering av p53 och Rb (7,8). Slutsats I föreliggande studie där prevalensen av HPV i biopsier från patienter med misstänkt PVL undersöktes i syfte att använda HPV som riskmarkör för utveckling av PVL, kan man dra slutsatsen att förekomsten av HPV ofta tycks öka vid progression av sjukdomen men det går inte att identifiera något säkert samband med hjälp av in situ hybridisering. Sambandet mellan HPV och PVL har redan ifrågasatts i tidigare studier (14)(13). Idag behandlas PVL-lesionerna på samma sätt som vanliga leukoplakier vilket innebär behandling med kirurgi i form av excision eller resektion, laser, kemoterapi, strålbehandling, retinoider eller kortikoider. Ingen av dessa behandlingsmetoder har visat sig vara effektiv. Det finns få studier publicerade som utreder olika behandlingsmetoders effektivitet. Målet med forskningen bör vara att finna etiologin för att kunna förbygga att lesionerna uppkommer. Det vore av stort värde att identifiera en riskmarkör för utveckling av PVL och få klarhet i etiologin för att i ett tidigt skede kunna ställa diagnos och utveckla behandlingsmetoder. 18

19 Referenser 1. Hansen LS, Olson JA, Silverman S,Jr. Proliferative verrucous leukoplakia. A long-term study of thirty patients. Oral Surg Oral Med Oral Pathol. 1985; 60: Cabay RJ, Morton TH,Jr, Epstein JB. Proliferative verrucous leukoplakia and its progression to oral carcinoma: a review of the literature. J Oral Pathol Med. 2007; 36: Parkin DM, Bray F. Chapter 2: The burden of HPV-related cancers. Vaccine. 2006; 24 Suppl 3: S3/ Shope RE, Hurst EW. Infectious Papillomatosis of Rabbits : with a Note on the Histopathology. J Exp Med. 1933; 58: Syrjanen K, Syrjanen S, Lamberg M, Pyrhonen S, Nuutinen J. Morphological and immunohistochemical evidence suggesting human papillomavirus (HPV) involvement in oral squamous cell carcinogenesis. Int J Oral Surg. 1983; 12: Jenkins D. A review of cross-protection against oncogenic HPV by an HPV-16/18 AS04- adjuvanted cervical cancer vaccine: importance of virological and clinical endpoints and implications for mass vaccination in cervical cancer prevention. Gynecol Oncol. 2008; 110: S Chaudhary AK, Singh M, Sundaram S, Mehrotra R. Role of human papillomavirus and its detection in potentially malignant and malignant head and neck lesions: updated review. Head Neck Oncol. 2009; 1: Ha PK, Califano JA. The role of human papillomavirus in oral carcinogenesis. Crit Rev Oral Biol Med. 2004; 15:

20 9. Syrjanen S, Rautava J, Willberg J. Humana papillomvirus och orala infektioner. Tandläkartidningen. 2012; 3: Doorbar J. Papillomavirus life cycle organization and biomarker selection. Dis Markers. 2007; 23: Syrjanen S. Humana papillomvirus och orala infektioner. Tandläkartidningen. 2006; 98 (2): Wu TC. Immunology of the human papilloma virus in relation to cancer. Curr Opin Immunol. 1994; 6: Campisi G, Giovannelli L, Ammatuna P, Capra G, Colella G, Di Liberto C et al. Proliferative verrucous vs conventional leukoplakia: no significantly increased risk of HPV infection. Oral Oncol. 2004; 40: Bagan JV, Jimenez Y, Murillo J, Gavalda C, Poveda R, Scully C et al. Lack of association between proliferative verrucous leukoplakia and human papillomavirus infection. J Oral Maxillofac Surg. 2007; 65: Feller L, Lemmer J. Oral Leukoplakia as It Relates to HPV Infection: A Review. Int J Dent. 2012; 2012: Miller CS, Johnstone BM. Human papillomavirus as a risk factor for oral squamous cell carcinoma: a meta-analysis, Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod. 2001; 91:

21 17. Nationalencyklopedin. in situ-hybridisering. ne se. ; ZytoVision GmbH. T , T , T , T , T ; Palefsky JM, Silverman S,Jr, Abdel-Salaam M, Daniels TE, Greenspan JS. Association between proliferative verrucous leukoplakia and infection with human papillomavirus type 16. J Oral Pathol Med. 1995; 24: Gopalakrishnan R, Weghorst CM, Lehman TA, Calvert RJ, Bijur G, Sabourin CL et al. Mutated and wild-type p53 expression and HPV integration in proliferative verrucous leukoplakia and oral squamous cell carcinoma. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod. 1997; 83: Boy S, Van Rensburg EJ, Engelbrecht S, Dreyer L, van Heerden M, van Heerden W. HPV detection in primary intra-oral squamous cell carcinomas--commensal, aetiological agent or contamination? J Oral Pathol Med. 2006; 35: Ha PK, Califano JA. The role of human papillomavirus in oral carcinogenesis. Crit Rev Oral Biol Med. 2004; 15: Chaudhary AK, Singh M, Sundaram S, Mehrotra R. Role of human papillomavirus and its detection in potentially malignant and malignant head and neck lesions: updated review. Head Neck Oncol. 2009; 1:

22 24. Syrjanen SM, Syrjanen KJ, Happonen RP. Human papillomavirus (HPV) DNA sequences in oral precancerous lesions and squamous cell carcinoma demonstrated by in situ hybridization. J Oral Pathol. 1988; 17:

23 Figurer Fig. 1a Fig. 1b Fig. 1c 23

24 Fig.2 Fig. 3 24

25 Fig. 4a Fig. 4b Fig. 5 25

26 Fig. 6a Fig. 6b Fig. 6c 26

27 Fig. 7a Fig. 7b 27

28 Figurtexter Fig. 1a-c: Eosininfärgade biopsier från patient 2 (se tabell 1) med återkommande lesioner på olika ställen i munnen. Fig. 1a: 2004: Verrukös hyperplasi med dysplasi i kindslemhinna. Fig. 1b: 2008: Lichenoid reaktion i gom Fig. 1c: 2011: Biopsi från läpp visar på skivepitelcancer med invasivt växande epitel Fig. 2: Modifierad version av Hansens histologiska illustration som visar diagnoser inkluderade i PVLs sjukdomsbild (1). Fig. 3: HPV-16-genom och integration i värdcellen (8). Fig. 4a-b: Närliggande seriesnitt hybridiserades med positiv (4a) och negativ (4b) kontrollprob visar att hela snittet har förmåga att färgas in positivt och den negativa visar att snittet inte färgas in ospecifikt. Dessa kontroller bekräftar att vårt resultat är korrekt Fig 5: Patient 5: Skivepitelcancer som visar positivitet med röda kärnor i basalcellslagret för screeningproben Fig. 6a-c: Patient 2 med epiteldysplasi som med röda kärnor i cellerna i basalcellslagret visar positivitet för screeningproben (HPV 6/11/16/18/31 /33/ 35/45/51/82) Fig. 7 a-b. Patient 1: Skivepitelcancer som visar positivitet för HPV 16/18 28

29 Tabell Patient nr Diagnos 6/11/16/18/31/33/35 /45/51/82 16/18 6/11 1 Skivepitelcancer + + Epiteldysplasi Verrucös cancer Epiteldysplasi Skivepitelcancer Verrukös hyperplasi + 4 Verrukös hyperplasi Benign hyperkeratos Skivepitelcancer Epiteldysplasi - 6 Skivepitelcancer Benign hyperkeratos - 7 Skivepitelcancer Lichenoid reaktion biopsi saknas 8 Verrukös hyperplasi+epiteldysplasi - Verrukös hyperplasi Verrukös cancer - 10 Skivepitelcancer - 11 Skivepitelcancer - Tabell 1. Visar resultaten för varje patientfall vid screening, HPV 6/11 och 16/18. 29