Korrekt fixering & dehydrering för den optimala resultatet

Storlek: px

Starta visningen från sidan:

Download "Korrekt fixering & dehydrering för den optimala resultatet"

Jonathan Åke Pålsson
för 8 år sedan
Visningar:

1 Korrekt fixering & dehydrering för den optimala resultatet Fixation, stabilization of protein, is the most important step in producing good histological slides Sheehan & Hrapchak Ett urval av artefakter/felkällor Ej optimal fixering Att tänka på vid utskärning Dehydrerings artefakter Överprocessad vävnad Underprocessad d vävnad Felaktig urkalkning Problem med färgning Artefakter Struktur som uppkommit genom felaktig vävnadsprocessing och som inte hör till normal eller patologiskt vävnad. Kan uppkomma i alla steg i den histopatologiska processen Optimal fixering av vävnadsprovet avgör hur bra resultat vi ser i mikroskopet. Efter excision läggs vävnadsprovet i en tillräckligt stor behållare med fixeringsmedel som oftast är 4% buffrad formaldehyd. Mängd fixeringsmedel skall vara 20:1. För att fixering ska bli optimal ska vävnadsprovet inte vara för tjockt, max 5mm för bästa möjliga morfologi. Fixeringstid för NBF 24timmar, går snabbare om man använder tex mikrovågor. 20:1 5:1 1

som uppkommit genom felaktig vävnadsprocessing och som inte hör till normal eller patologiskt vävnad.

2 Välj rätt storlek på burkar vid fixering Vid fixering bör alla vävnader vara högst 5mm tjocka! Vid utskärning ska de utskurna bitarna inte vara för tjocka, i en standardkassett ska maximalt 4mm tjocka bitar läggas. Optimal volym 20:1, VIKTIGT Det måste finnas utrymme för vätskor att passera under själva dehydrering och infiltrationsstegen. Fixering Felaktig fixering är största orsaken till dåliga färgresultat! Ger oåterkalleliga fel Felaktig fixering kan bero på en mängd olika saker Fixering - ofullständig För tjock vävnad otillräcklig penetration För liten volym formaldehyd För kort tid i fixeringslösning Förbrukad fixeringslösning Inget skydd av vävnad under processning Suddiga kärnor Skrumpna celler Dålig morfologi Nuclear bubbling Vävnadskomponenter spricker på vattenbadet vid snittning 2

Optimal volym 20:1, VIKTIGT Det måste finnas utrymme för vätskor att passera under själva dehydrering och infiltrationsstegen. Fixering Felaktig fixering är största orsaken till dåliga färgresultat!

3 När inte optimal fixering utförts uppstår olika typer av artefakter. Om fixering är fördröjd kan följande problem uppstå. Kärnor - Kan visa förlust, blekning eller fullständigt försvinnande av kromatin. Celler - Vissa celler kan visa krympning och vissa celler kan helt försvinna, t.ex. epitelceller av mag-tarmkanalen. Gastric biopsy, NBF, H&E. 20x Otillräcklig fixering -> suddiga kärnor. Syns först i epitelieceller. Autolys sker och prover blir inte tillräckligt stabiliserade för att motstå påfrestningarna som uppkommer under processning och torkning av glasen Nuclear bubbling artefakt kan uppstå när man inte fixerat optimalt med NBF och i kombination med värme någonstans i processen. När vävnaden inte är tillräckligt fixerad uppstår inte det luckra nät som möjliggör penetration av kemikalierna under dehydreringsprocessen. Man får då hålrum som ser ut som bubblor. Gastric biopsy, NBF, H&E, 50x Vid svåra fall av otillräckligt fixering försvinner kärnan helt 3

Gastric biopsy, NBF, H&E. 20x Otillräcklig fixering -> suddiga kärnor. Syns först i epitelieceller.

4 Fixering startar för sent Kärnorna är för svagt färgade eller försvunna, kromatin syns dåligt Celler skrumpnar, cytoplasma går sönder, celler försvinner helt Fixering Fel ph i formaldehydlösning < ph 6 formaldehyd + hemoglobin mörkbrun, kristallin fällning Formaldehydpigment Bruna kristaller som syns i vävnad efter att den fixerats i sur formaldehyd. Formaldehyden bildar myrsyra när den förvaras under längre tid och i den sura miljön bildas kristallerna. Undviks genom att buffra formaldehyden. Njure, autolys, ingen kärna i vissa av tubuli Dehydrering - Syfte- att dra ur det fria vattnet från vävnaden. - Fria vattnet - Bundna vattnet Tjocklek av vävnadsprovet- max 3-4 mm Fyll inte en kassett helt med vävnad vid utskärningen, det måste finnas utrymme för utbyte av vätskor under processingen 4

Formaldehyden bildar myrsyra när den förvaras under längre tid och i den sura miljön bildas kristallerna. Undviks genom att buffra formaldehyden.

5 Överprocessad vävnad För mycket vatten borttaget från vävnaden Ej optimal körning i dehydreringsutrustning pga. att alla sorts prover körs tillsammans i samma program Dela upp vävnadsprover efter tjocklek och hur feta de är och använd fler program i dehydreringsutrustningarna Små biopsier körs i kortprogram (1-2h) Standard kassetter över natt körning i traditionell utrustning eller 3,5-6 tim med mikrovågor (ca 6 h med fixering) Storsnitt kassetter i eget program över natt i mikrovågor annars upp till 48h. Återfuktning krävs för att kunna få fina snitt Överprocessad vävnad För mycket vatten borttaget från vävnaden Skrumpen vävnad, stark infärgning Torra och spröda vävnadsprover som är svåra att snitta Vid snittning komprimeras och/eller spricker vävnaden lätt Mikroshatter uppstår lätt vid snittning i Snitt kan repas vid snittning Återfuktning krävs för att kunna få fina snitt Underprocessad vävnad För lite vatten borttaget från vävnaden Vita fläckar i klossar Svåra att snitta Mikrochatter pga överdehydrerad vävnad För lång tid i dehydrering Efter återfuktning Kontrollera fixering är optimalt utförd Ej optimal körning i dehydreringsutrustning pga. att alla sorts prover körs tillsammans i samma program Dela upp vävnadsprover efter tjocklek och hur feta de är och använd fler program i dehydreringsutrustningarna Stora feta preparat i eget program över natt i utrustning med mikrovågor annars upp till 48h i traditionell utrustning Öka tider i program, byt lösningar i tid 5

(1-2h) Standard kassetter över natt körning i traditionell utrustning eller 3,5-6 tim med mikrovågor (ca 6 h med fixering) Storsnitt kassetter i eget program över natt i mikrovågor annars upp till

6 Underprocessad vävnad För lite vatten borttaget från vävnaden Vita fläckar i klossar Svåra att snitta Dehydreringsartefakter För kort tid i fixering kan ge en kombinationsfixering formaldehyd/etanol Beror ofta på undermålig fixering Dålig infiltration av paraffin ger hål vid snittning Vävnadssnitt kan falla av vid snittning Vävnadssnitt exploderar i vattenbad Stor skillnad i morfologi Mer skrumpen vävnad Starkare infärgning av vävnadskomponenter Fosfater från formaldehydfixeringen kvar i vävnader Öka tider i program, byt lösningar i tid Ger repor i snitten Urkalkning Överurkalkad ingen kärnfärgning Urkalkning Underurkalkad kalcium färgas mörkblått av HTX Väl synliga kärnor (lila). Ingen kärnfärgning pga överurkalkning Källa: Histotechnology, a self-instructional text. Frieda L. Carson 6

skrumpen vävnad Starkare infärgning av vävnadskomponenter Fosfater från formaldehydfixeringen kvar i vävnader Öka tider i program, byt lösningar i tid Ger repor i snitten Urkalkning Överurkalkad

7 Tack för mig Afsaneh Safari (Affe) 7

Relevanta dokument

CELLABVECKAN 2015 CELLABVECKAN 2015

CELLABVECKAN 2015 CELLABVECKAN 2015 Cellabveckan är ett årligt evenemang som i år arrangeras för femte året i rad. De två sista dagarna av veckan ägnades åt histologi. Deltagare från hela Sverige bjöds