CMV/EBV Molekylär diagnostik. Annika Allard Klinisk Mikrobiologi/Virologi Norrlands Universitetssjukhus

Transkript

1 CMV/EBV Molekylär diagnostik Annika Allard Klinisk Mikrobiologi/Virologi Norrlands Universitetssjukhus

2 De flesta CMV infektioner hos immunkompetenta individer är asymtomatiska eller ger bara en mkt mild sjukdomsbild. CMV kan dock orsaka allvarliga sjukdomar hos nyfödda och immunosupprimerade CMV CMV sprider sig i blodet och kan därför hamna i alla organ. En reaktivering kan därför uppträda var som helst i kroppen. Latenta CMV genom finns närvarande i makrofager, mononukleära celler, neutrofiler, polymorfonukleära celler, epitel- och endotelceller, fibroblaster, neuron celler och parekymceller. Finns också i olika vävnader som benmärg, lever, njure, mag- och tarmkanal, lungor och hjärna. CMV är det vanligaste virus som infekterar mottagare av solida organ. Orsakar död och svår sjukdom liksom organavstötning, ökad risk för opportunistiska sjukdomar.

3 I N F ECTIONS I N I M M U NOCOMPROMISED H O S T S A N D O RGAN T R A N S P L A NT R E C IPIENTS: E S S E N T IALS Molekylär diagnostik Jay A Fishman, Liver Transplantation Volume 17, Issue S3, pages S34-S37, 26 OCT 2011

4 Virusmängd/viral load Kopplad till svårighetsgrad av sjukdom Längd av behandling/effektivitet av behandling Förebygga onödig behandling/förutspå drogresistens Indikera risk för kliniskt återfall När det gäller NAAT metoder så är det viktigt att ha metoder som kan särskilja en aktiv viral infektion från detektion av latent viralt DNA, dvs att skilja på en sann infektion från viral latens.

5 Provmaterial Olika delar av blod kan användas; Leukocyt preppar, helblod, Plasma och serum. CMV i plasma och serum har frisläppts från aktivt infekterade celler och detektion i dessa vätskor anses därför vara mer specifika för en aktiv CMV infektion. CMV fynd i leukocyter eller helblod återspeglar en cellassocierad latent CMV.

6 Ökning viruskopior per dag Emery et al. Lancet 355: , 2000 Procentuell risk för CMV relaterad sjukdom 64% 16% Mängd virus taget initialt i första provet En hög initial titer av CMV eller en mkt snabb ökning av virusmängd förutspår en utveckling av CMV sjukdom. CMV dubbleringstid är timmar därför kan även låga nivåer bli farliga snabbt hos immunosupprimerade individer.

7 EBV 90-95% av alla vuxna är EBV seropositiva. Eftersom EBV kvarstår i B-celler livet ut så kan latenta virus hittas i leukocyter (1-2 genomkopior/cellkärna i episomal form). Hos immunokompetenta är EBV DNA detekterbart i serum i ca 7 dagar efter start av symptom. Serologi används istället för PCR.

8 provmaterial Tittat på 33 patienter med HIV och B-cells lymphom Renade B-celler 100% EBV Supernatant av odlade B-celler 82% EBV Plasma 57% EBV Helblod 42% EBV Al Tabaa et al. J Clin Virol, 52:33-37,2011 Serum/plasma = cirkulerande celler = cellfritt EBV Helblod = cellbundet EBV

9 Plasma: Bara aktivt replikerande virus som släppts ut från celler, vilket korrelerar bättre med klinisk sjukdom. Helblod: EBV episomalt DNA mäts. Tidigare detektion än med plasma. I plasma bara fritt DNA, vilket blir en sen markör för EBV. Alltså skall helblod användas. Får då med celler med virus, lymfocyter, cellfria material. Helblod är en tidigare markör.

10 Primär EBV infektion Efter en transplantation Gulley and Tang, Clin Microbiol Rev 23: , 2010

11 PROBLEM INOM DIAGNOSTIKEN Många studier har nu visat att olika kvantitativa standarder har en dramatisk effekt på viral load resultat. Avvikelser när det gäller kvantitativa analyser inom kemi brukar ge CV (variationskoefficient) som varierar mellan 1-5%, medan realtids PCR för virologiska analyser har CV på mellan 30-40% eller mer. Jämförelser mellan olika lab kan vissa på skillnader i virusmängd mellan x. När det gäller tex HCV och HIV har man kommit långt med internationella kvantitativa standarder, FDA godkända tester, kalibrerings standarder etc vilket gjort att man har en ökad samstämmighet både inom och mellan olika laboratorier.

12 WHO International Standard 1st WHO International Standard for Human Cytomegalovirus for Nucleic Acid Amplification Techniques NIBSC code: 09/162 Instructions for use (Version 6.0, Dated 09/10/2014) WHO International Standard 1st WHO International Standard for Epstein-Barr Virus for Nucleic Acid AmplificationTechniques NIBSC code: 09/260 Instructions for use (Version 4.0, Dated 09/10/2014) 5 ^ 10 6 kopior/ml

13 Skillnad på koncentration beroende på vilket material man späder standarden i. Om man späder i helblod så fås en lägre koncentration än spädning i plasma. Ungefär 0.5 logs skillnad. Man bör kolla själv hur det ser ut med sin egen detektions-assay; skillnader mellan in-house och kommersiella metoder. Nya analyser skall publiceras under 2015 med WHO standarden Förutom positiv standard så borde allt standardiseras, provtagning, NA extraktion, amplifiering, detektion etc.

14 Hayden et al JCM 50: , 2011 Tester gjordes med 165 lab deltagare: 147 lab CMV, 88 lab EBV CMV ingen större variation mellan användning av inhouse och kommersiella test. EBV större variabilitet mellan lab som körde med inhouse. Extraktionsmetoder; bäst med liquid phase, sedan silicabaserad prep och sist magnetic beads. Val av target gen var inte heller utslagsgivande; Taqmanprober ngt sämre än FRET prober.

15 Anledning till variationer CMV EBV Kommersiella tester 47.1% Målgen för amplifiering 9.6% Interaktion mellan reagenser och val av gen för amplifiering 7.2% Extraktionsmetod 3.4% Kommersiella tester 10.8% Dålig kalibrering för kvantifiering 10.6% Interaktion mellan provmaterial och målgen för amplifiering 8.3% Extraktionsmetod 7% Målgen för amplifiering 7.1% Pipetteringsmetod 5% Interaktion mellan extraktionsmetod och amplifiering av målgen 5.3% + lite till

16 Inga studier har ännu inkluderat pre-extraktionsförfarande (framförallt transportförhållanden) samt hur proven lagras innan analys. Tack för er uppmärksamhet!