FilmArray - helautomatiserad multiplex likvordiagnostik

Transkript

1 FilmArray - helautomatiserad multiplex likvordiagnostik Sara Thulin Hedberg, Molekylärbiolog, PhD David Nestor, Sara Thulin Hedberg, Paula Mölling & Martin Sundqvist Laboratoriemedicinska Länskliniken, Molekylärdiagnostik F&U /Klinisk Mikrobiologi, Universitetssjukhuset Örebro

2 Meningit = Hjärnhinneinflammation Encefalit = Hjärninflammation CNS-infektioner Kan orsakas av bakterier, virus & jästsvampar Bakteriell meningit ofta mer akut och vårdkrävande än viral Akut CNS-infektion Hög morbiditet och ibland även mortalitet Huvudvärk, feber, nackstelhet, ljuskänslighet, men varierar beroende på etiologi

3 Meningit-agens, bakterier & jästsvamp Patogen Streptococcus pneumoniae Neisseria meningitidis Haemophilus influenzae Listeria monocytogenes Streptococcus agalactiae Escherichia coli Borrelia burgdorferi Cryptococcus neoformans Cryptococcus gattii Prevalens/Incidens ~50 % av alla fall av BM ~10 % av alla fall av BM ~5 % av alla fall av BM (efter vaccinationsinförande) ~5 % av alla fall av BM ~5 % av alla fall av BM ~5 % av alla fall av BM ~70/ /år ffa bland HIV-patienter ffa bland HIV-patienter

4 Meningit/encefalit-agens, virus Patogen Enterovirus (EV) Herpes Simplex Virus 1 (HSV-1) Herpes Simplex Virus 2 (HSV-2) Varicella Zooster Virus (VZV) Cytomegalo Virus (CMV) Epstein-Barr Virus (EBV) Humant Herpes Virus 6 (HHV6) Humant Parechovirus (HPeV) Flaviviridae spp Prevalens/Incidens Vanligaste orsaken till aseptisk meningit (85-95 % av identifierade agens) ~2-3/ /år, 90 % av alla HSVorsakade encefaliter ~7-10 % av alla fall av viral meningit Rel. hög incidens i Sverige jämf. med länder med VZV-vac. Sällan primär CNS-patogen Sällan primär CNS-patogen Sällan primär CNS-patogen Förekommer globalt TBE-fall/år i Sverige

5 Diagnostik av meningit/encefalit Svårt att särskilja vilket agens (bakt/virus/svamp) som orsakat CNS-infektion baserat bara på kliniska symptom och biokemiska tester Odling av bakterier: känslig metod, men tar tid, risk för falskt neg vid ab-behandling PCR bra för detektion av både bakterier, virus och svamp i CSF, men kräver molekylärbiologiskt kunnig personal, ej 24/7 behov av en snabb, enkel molekylärbiologisk analys

6 Syfte Att utvärdera en helautomatisk Meningit/Encefalit-panel från FilmArray

7 Material Material & Metod 32 frysta kliniska CSF-prover S. pneumoniae (n=13), N. meningitidis (n=4), HSV-1 (n=4), HSV-2 (n=3), VZV (n=3), Enterovirus (n=5) Spikade prover, spädningsserier i negativ CSF; S. pneumoniae, N. meningitidis, L. monocytogenes, S. agalatiae, HSV-1, HSV-2, VZV EQA-prover; UK NEQAS; Virus i CSF (HSV-1 n=1; VZV n=1; EV n=2) Panel för tre-labs-jämförelse; H. influenzae (n=2), S. pneumoniae (n=2), N. meningitidis (n=2)

8 Material & Metod FilmArray Meningitis/Encephalitis, RUO (BioMerieux) 200 µl CSF-prov mixas med 300 µl lysis buffer och laddas i pouchen Pouchen placeras i FilmArray-instrumentet, analysen startar Total analystid 75 min, inkl 5 min hands-on Endast kvalitativ: Positiv/Negativ

9 FilmArray Meningitis/Encephalitis DNA/RNA-extraktion Kulor & Magnetpartilar RT-PCR Nestad PCR IC RNA-kontroll hela processen DNA-kontroll PCR II PCR II Varje target amplifieras i 3 individuella brunnar

10 FilmArray Meningitis/Encephalitis (ME) panel Bakterier Streptococcus pneumoniae Neisseria meningitidis Haemophilus influenzae Listeria monocytogenes Streptococcus agalactiae Escherichia coli Jäst Cryptococcus neoformans Cryptococcus gattii Virus Enterovirus (EV) Herpes Simplex Virus 1 (HSV-1) Herpes Simplex Virus 2 (HSV-2) Varicella Zooster Virus (VZV) Cytomegalo Virus (CMV) Epstein-Barr Virus (EBV) Humant Herpes Virus 6 (HHV6) Humant Parechovirus (HPeV)

11 Material & Metod Inhouse-PCR Bakteriell meningit (Thulin Hedberg et al. APMIS 2009) DNA-extraktion: MagNA Pure Compact PCR: LightCycler 2.0 S. pneumoniae lyta H. influenzae P6 S. agalactiae cfb L. monocytogenes hly N. meningitidis ctra/crga 16S U2-U3 SP GBS MC 16S HI LM Detektionsnivå: ca bakt/specifik PCR

12 Resultat Spädningsserier, bakterier Patogen Spädning FilmArray ME Inhouse S. pneumoniae 1/ / NA 1/ N. meningitidis 1/ / NA 1/ S. agalactiae 1/ / / NA 1/ L. monocytogenes 1/ / / NA 1/ Svagt positiv om man tittar på smältkurvan

13 Resultat Spädningsserier, virus Patogen Konc. (kopior/ml) FilmArray ME HSV-1* NA 10 - HSV-2* VZV* Kliniskt HSV-1-positivt prov, kvantifierat vid Sahlgrenska Konc. (kopior/ml) FilmArray ME * Kontroller från Qnostics med känd ursprungskoncentration 1 Svagt positiv om man tittar på smältkurvan

14 Patogen Resultat Kliniska prover, FilmArray ME Antal positiva prover Kommentar S. pneumoniae 12/13 Det neg provet från 2006, detekterad med nestad end-point PCR. I ME analyserat i mix med spikat virusprov. 2 prov även pos för HHV-6 med ME, kunde ej verifieras vid Sahlgrenska. N. meningitidis 4/4 Ett prov även pos även för Pne med ME, verifierat med in-house PCR. HSV-1 4/4 HSV-2 2/3 Det neg provet hade Ct 39 vid primäranalys. VZV 2/3 Det neg provet hade Ct 38 vid primäranalys, även pos för E. coli i ME, ej verifierad med in-house PCR. Ett prov även pos för EBV med ME, kunde ej verifieras vid Sahlgrenska. Enterovirus 4/5 Det neg provet analyserades sp 1:2 i ME pga bristande ursprungsmaterial.

15 Resultat EQA-prover Samtliga EQA-prover identifierades korrekt med FilmArray ME UK NEQAS; 1 HSV-1, 1 VZV, 2 EV Panel för tre-labs-jämförelse; 2 H. influenzae, 2 S. pneumoniae, 2 N. meningitidis

16 Bred analyspanel, användarvänlig, lite hands-on och kort analystid, MEN endast kvalitativ och låg troughput Bra specificitet Endast 0,4 % oväntat positiva resultat som inte kunde verifieras (1 E.coli, 1 EBV & 2 HHV-6) EBV kommer inte vara med i det kommersiella kitet 5-10 lägre känslighet för de testade bakterierna jämfört med inhouse- PCR, men endast ett kliniskt prov missas Bra känslighet för HSV-2, VZV (~100 kopior/reaktion) och EV (jämförbar med in-house PCR) Spretiga resultat för HSV-1 Konklusioner Låg känslighet vid test av Qnostics kontroll, men hög känslighet vid spädning av kliniskt prov Fler tester av HSV-1 ska göras Dubbelpositivitet verkar inte vara ett problem

17 Tack! Labben i Linköping och Växjö för kliniska virus-positiva prov! Klinisk mikrobiologi, Sahlgrenska för verifieringsanalys av virusprover!