DNA FRÅN BLOD & KINDCELLER

Storlek: px

Starta visningen från sidan:

Download "DNA FRÅN BLOD & KINDCELLER"

Georg Olofsson
för 8 år sedan
Visningar:

1 EQUALIS Användarmöte, Molekylärdiagnostik 2012 Quality Hotel, Ekoxen, Linköping 7 8 november, 2012 DNA FRÅN BLOD & KINDCELLER Majid Osman, kemist, PhD Klinisk kemi, Linköping

2 DNA stabilitet Provtagning Extraktion Rör DNA integritet Medium Transport Analysresultat Förvaring

3 Rör Laboratoriemedicin Färgkoder för säkerhetskork på vakuumrör för provtagning av venöst blod enligt SVENSK STANDARD SS

4 Förvaring av blod för DNA-analys Rumstemperatur +4 C -20 C -80 C DNA yields after blood storage. DNA was purified in triplicate from 300 µl fresh whole blood preserved in ACD, EDTA, or heparin on day 0 and after storage for 3 days, 1 week, 2 weeks, or 4 weeks at room temperature (22 C), 4 C, 20 C, or 80 C using the Gentra Puregene Blood Kit. (

DNA was purified in triplicate from 300 µl fresh whole blood preserved in ACD, EDTA, or

5 ph och jonstyrka påverkar DNAstabilitet DNA skador Depurinering, (depyrimidinering) hydrolys Deaminering Oxidativ attack Icke-enzymatisk metylering Nature 1993;362(6422):

6 ph och jonstyrka påverkar DNAstabilitet TE-buffert (ph 9.0) Nucleas-fri H 2 0 (ph 6 7) DNA was eluted in Buffer AE or water, and stored for 8 years at 2 8ºC or 20ºC. M: marker (λ HindIII).

7 Extraktion av DNA från blod Lysering av celler (helblod/ buffy coat) Detergenter, salter, alkalisk behandling, etc. vätske-vätske extraktion Kolonnfiltrering Magnetisk rening Centrifugering Etanolfällning Centrifugering Centrifugering/ vakuum Tvätt Eluering med H 2 O/ TE-buffert Tvätt Eluering med H 2 O/ TE-buffert

vätske-vätske extraktion Kolonnfiltrering Magnetisk rening Centrifugering

8 Hur mycket DNA kan vi få från blod? En diploid cell innehåller ~ 6 pg DNA (haploider ~ 3 pg). En vuxen person har 3,5 8,8 x 10 9 leukocyter/l blod. Teoretiskt utbyte: ng DNA/µL blod.

9 Hur mycket DNA får vi? Jämförelse mellan 3 DNA extraktionsrobotar Instrument Teknik Företag Utbyte (ng DNA/µL blod) EZ1 Biorobot MagNA Pure LC system iprep Purification Instrument Magnetisk partiklar Magnetisk partiklar ChargeSwitch ligand Qiagen Roche Life Technologies upptill 43

Utbyte (ng DNA/µL blod) EZ1 Biorobot MagNA Pure LC system iprep

10 Hur mycket DNA behöver vi? Jämförelse mellan olika qpcr kemi* Kemi LOD (# kopior DNA) TaqMan (probe baserad) LNA (probe baserad) 4 20 CPT (probe baserad) LUX (fluorescerande primer) Plexor (fluorescerande primer) LOQ (# kopior DNA) Gasparic et al. BMC Biotechnology 2008, 8:26 *Transkript=Växt-invertas LOD: Limit of detection (detektionsgräns) LOQ: Limit of quantification (lägsta kvantifierbara mängd)

baserad) 4 20 CPT (probe baserad) 20 400 LUX (fluorescerande primer) 4 200 Plexor (fluorescerande primer) 4

11 PCR-inhibitorer i DNA prover Heparin Polyaminer Polysackarider Fenoler Hemolys (hemgruppen) SDS Proteinase K Guanidinium Natriumacetat M. fl. Ursprung: provrör blod extraktionsreagens etc

12 PCR-inhibitorer i DNA prover NTC Ospätt A 10 spätt A Ospätt B Marker 10 spätt B Ospätt C 10 spätt C En okänd PCRinhibitor förhindrar sekvensamplifiering Inhibitorn späds ut och sekvensen kan amplifieras

13 Inhibitorer ändrar PCR-effektivitet Utan inhibitor y = -3,3454x + 35,35 Effektivitet = 99% Med inhibitor y = -2,0414x + 32,243 Effektivitet = 209% E = 10^(-1/k) -1 k = lutning Lutning Effektivitet -3,20 105% -3,32 100% -3,5 93% -3,6 90% -3,8 83% -4,0 78% Acceptabel effektivitet: % ( 3.6 lutning 3.20)

= 10^(-1/k) -1 k = lutning Lutning Effektivitet -3,20 105% -3,32 100% -3,5

14 Buccal DNA (DNA från kindens insida) + Enkel provtagning Lämplig för genotypning Lämplig för epidemiologiska och GWAS studier Stora inter-individuella variationer Kontaminerad av bakterie DNA Fragmentstorlek?

15 Tekniker för extraktion av DNA från kindceller Skrap från kindens insida/ pelleterade celler från munskölj Värmelysering, inaktivering av föroreningar i hög temperatur Kemisk lysering Salting -out Alkoholfällning, Centrifugering, m.m. Kemisk lysering Rening med Magnetisk partiklar Tvätt, eluering Kemisk lysering DNAsuspension Kolonnfiltrering Centrifugering, tvätt, eluering Epicentre Qiagen Life Technology, Qiagen Promega

16 Buccal DNA: inom-individ variation och kvalitet Satia-Abouta et al. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 2002, 11:1130

17 Kvantifiering av DNA Garcia-Closas et al. Biomarkers 2006, 11(5):472

18 Kvantifiering av DNA Nanodrop ger falskt förhöjda DNA mängder vid låga värden Buccal DNA extraherat med kit från Epicentre Utbyte enligt leverantören (ng/µl) Observerade koncentrationer (ng/µl) (n = 35)

från Epicentre Utbyte enligt leverantören (ng/µl) 2

Relevanta dokument

Molekylärbiologisk diagnostik av tarmparasiter

Molekylärbiologisk diagnostik av tarmparasiter Vad, När, Var och Hur? Jessica Ögren Länssjukhuset Ryhov Juni 2012 Molekylärbiologiska metoder De senaste två decennierna har molekylärbiologiska tekniker