Clostridium difficile diagnostik. Lucía Ortega Klinisk Mikrobiologi Växjö

Transkript

1 Clostridium difficile diagnostik Lucía Ortega Klinisk Mikrobiologi Växjö

2 Clostridium difficile Anaerob, gram positiv stav Sporbildande Producerar toxiner som A och B Orsakar diarré/kolit

3 Indikation: Diarre i samband med eller upp till 3 veckor efter antibiotikabehandling Screening vid diarréutbrott på vårdavdelning (skall ske i samråd med Vårdhygien) Annan misstanke om C. difficile-orsakad diarré/kolit.

4 Toxintest : Illumigene (Orion diagnostica) Molekylärmetod: LAMP metod Detekterar Patogen Locus (PaLoc) Kvalitativ test Ca 1 timme köra 10 st prover Prover hållbart i kyl i 5 dgr och RT i 24h

5 Utbrott December 2013 Fredagen den 6/ blev HJ uppringd av en orolig IVA-läkare från Centrallasarettet i Växjö. En patient hade nyligen avlidit i pseudomembranös kolit och nu var ytterligare en patient dålig. r027?

6 Hur hanterade vi det förmodade utbrottet? Aktuella prov från december och äldre frysta prov odlas på TCCFA och skickas till Örebro för ribotypning. Miljöodling på aktuella patientsalar kir avd/iva Tryckplatta FAA Copanrör TCCFA CD-analys på caliciprov

7 Svar på ribotypning 23 dec: Verifierad C. difficile r027 hos 6 patienter i flera miljöodlingar sannolikt var ytterligare 1 patient positiv ej verifierad

8 Hur kan vi ge ett snabbt svar om påvisad r027? Ett till instrument Illumigene C. difficile Två körningar CD-toxin/dag samt körning på helg Odlingsdiagnostik påbörjas Klockor istället för An-box pga feceslavemang Utbrottsansvarig BMA utses

9 Diagnostik Odling på TCCFA (best. fr. Karolinska), 2 dygn i klocka, an miljö, med miljökontroll (aerotolerant C. perfringens + Metronidazol lapp, zon >27 mm) Misstänkta kolonier (gula) kördes på MALDI samt isolerades till FAA, inkuberades 1 dygn i klocka, an miljö. Resistensbestämning (1,0 McF) från FAA-isolering: FAA platta + Moxifloxacin (Mox R) Och nu då? Vad vågar/kan vi svara?

10 Diagnostik: Stammar skickades till Örebro för ribotypning Stort behov från vården att få svar! Trots samma handläggning av CD-patienter. Vad kan vi göra med MALDI? Påbörjar arbetet med egen MSP Kontaktar Kristina Rizzardi,FHM, angående nytt MALDI-protokoll. Metodbeskrivning och matrix skickas samma dag

11 MALDI-TOF i CD-utbrottet:MSP Testade att jämföra spektrum från utbrottsklon som verifierats i Örebro. Spektra ej helt identiska. Variationer beroende på medium samt hur de mår. Stor osäkerhet vid manuell bedömning. Skapade MSP från verifierad klon. Blastade mot 027 och icke-027. Alla fick score value >2. Ej användbart. Tog bort alla toppar i MSPn utom 7st. Testade om: Score value: >1,7 = r027 <1,7 = ej r027

12

13 MALDI-TOF i CD-utbrottet Litet material, snabbt skapad MSP (ej optimal), men någorlunda fungerande som screeningmodell. Resultat: r027: 86% rätt (n=63 med dubbletter - 10 fel, dock 9 korrekt vid omkörning) ej r027: 96% rätt (n= fel) Brister: Känsligt för orent material, måste vara färsk från FAA. (bättre MSP samt re-analys)

14 MALDI-TOF i CD-utbrottet: HMW Metod från Kristina Rizzardi, FHM HMW >20kDa Annan matrix (Ferulic acid) Manuellt hanterande 100% överensstämmande med r027 Tittar efter 2 specifika toppar Utesluta spridning annan klon

15 Diagnostik Positiv LAMP för toxingen ID med MALDI: C. difficile Moxifloxacin: R 2 icke tidigare testade metoder med MALDI Vågar vi nu svara att det är r027? Eller kan vi få till en genetisk verifiering av r027?

16 En enkel genetisk metod? slpa slpa sekvenstyperna: gr hr fr gc8 078 korrelerar med Ribotyperna: detekteras på vanlig agarosgel

17 slpa PCR för r027 (med tcdb) Hittar 65 av 65 isolat Ej känslig för tillväxtfas Kräver ej renkultur Inget isolat falskt positivt -Svarar bara på r027 eller ej -Toxin B toppen är förskjuten på vissa isolat

18 Diagnostik nu Positiv LAMP för toxigen Odling ID med MALDI: C. difficile, score >1,7 Moxifloxacin: R slpa r027-pcr (Allt görs från färska FAA isoleringar för bättre resultat) I studiesyfte fortsätter vi med: MSP r027 (måste förbättras) HMW

19 TACK! Håkan Janson, Mikrobiolog Åsa Johansson, Maldi-Tof ansvarig Maria Bergdahl, Molekyläransvarig Lucía Ortega, utbrottsansvarig