HEMOGLOBINOPATI Medicinsk bakgrund och diagnostik Camilla Valtonen-André 2011-11-09
Vad är hemoglobinopati? Hemoglobinopati ; sjukt/abnormt hemoglobin (Hb) Ärftlig sjukdom som drabbar de röda blodkropparna Varierande sjukdomsbild Känsliga blodkroppar Dålig syrebindande förmåga För lite hemoglobin
Hemoglobinopati
Talassemi
Talassemi Talassemi är ett gammalt och välkänt begrepp Thalassa=hav (medelhavet) Sjuka patienter med blodbrist Autosomalt recessivt
Olika thalassemier β-thalassemi Medelhavsområdet α-talassemi Sydostasien Dock finns en stor spridning och uppblandning Hb-varinaterna har ockxå olika spridning och vanlighet
Patientklientelet Beta-talassemi Alfa-talassemi Varianter Blandformer Malmö; Ca 300 000 inv Ca 170 nationaliteter
Klinik Mycket varierande klinisk bild Tusentals olika genetiska förändringar Vad avgör om det blir allvarligt?
Talassemi α-talassemi β-talassemi Klassiska monogena sjukdomar Patientens kliniska bild är beroende hur allvarig mutationen är för genens/proteinets funktion
Olika hemoglobinformer HEMOGLOBIN Mätbara tetramerer hos barn och vuxna ααββ; HbA (ca 97%) ααδδ; HbA2 ( 2,4-3,3 %) ααγγ; HbF (<1,1%)
Patient 1 från Somalia Anemi. Blek, trött och andfådd. Rikliga mens + flera täta graviditeter Fe-behandling hjälper inte HB 91, MCH 20, MCV 69 Hb-fraktionering beställs. Thalassemi? Hbvariant?
Beställning Remiss Hemoglobinfraktionering
Patient 1 från Somalia Anemi. Blek, trött och andfådd. Rikliga mens + flera täta graviditeter Fe-behandling hjälper inte Hb 91, MCH 20, MCV 69 Lab utreder vidare; MCH = 21 HbA2 = 5,3% HbF = 3,1% Kromatogram (och gel) visar inga varianter Prov vidare till DNA
Patientfall 1; DNA HBB:c.315+1G>C HBB:c.315+1G/C. Heterozygot Beta-noll-talassemi Beta-talassemia minor
Patientfall 1; beta-talassemia minor Obehandlad beta minior Mild anemi som under normala förhållanden inte ger några symtom Anemin kan förvärras av järn- eller folsyrabrist, vid infektioner, graviditet osv. Ungefär 10 procent får lever- och mjältförstoring.
Patientfall 2 4 mån gammal Trött och slö. Äter dåligt. Blek. Föräldrar är kusiner från Irak Hb 51-80, MCH 18, MCV 62, Fe? Fått blodtranfusion inneliggande
Patientfall 2 3 mån gammal Trött och slö. Äter dåligt. Blek. Föräldrar är kusiner från Irak Hb 51-80, MCH 17-20, MCV 62, Fe? Fått blodtranfusion inneliggande Lab utreder vidare; MCH =20 HbA2 = 4,3% HbF = 70%? Kromatogram (och gel) visar inga varianter. Man ser HbA. Är provet taget före eller efter transfusion? Prov vidare till DNA
Patientfall 2; DNA HBB:c.1A>G HBB:c.1G/G. Homozygot Beta-noll-talassemi Beta-talassemia major
Patientfall 2; beta-talassemia major Obehandlad Symtom debuterar redan under första levnadsåret Blekhet, trötthet till följd av anemi, tillväxthämning, försenad motorisk och intellektuell utveckling Kompensatoriskt ökad blodkroppsproduktion Kraftig lever- och mjältförstoring Vidgade märghålor i skelettet Förtunning av benvävnaden Benskörhet, frakturer Utan blodtransfusioner avlider de flesta med sjukdomen i 2-3 års ålder Hjärtsvikt stora blodvolymen syrgasbristen Behandlad Blodtransfusioner Kelatterapi (desferrioxamin) Järnöverskott pga blodtransfusion ökade järnupptaget från mag-tarmkanalen Utan behandling mot järnöverskottet utvecklas vid 10-15 års ålder fortskridande livshotande hjärtsvikt Även vid behandling med desferrioxamin sker järnupplagringen som på sikt innebär en förkortad livslängd Benmärgstransplantation
Patientfall 3 spontanaborteras ve 27 Hydrops fetalis Generella öden pga grav fetal anemi och cirkulatorisk/kardiell svikt Mor har varit gravid 7 ggr. 5 spontanaborter i tidig graviditet Mor och far från Thailand DNA-prov och blodprov togs
Patientfall 3 spontanaborteras ve 27 Hydrops fetalis Generella öden pga grav fetal anemi och cirkulatorisk/kardiell svikt Mor har varit gravid 7 ggr. 5 spontanaborter i tidig graviditet Mor och far från Thailand DNA-prov och blodprov togs Lab utreder vidare; Inga blodparametrar (för gammalt postmortem-prov) Kromatogram visar total avsaknad av normala toppar Obs! Fosterprov
Patientfall 3; DNA Ingen sekvens över alfagenerna gick upp MLPA visar homozygot deletion över båda alfagenerna Homozygot SEA -- SEA /-- SEA Hb Barts När de embryonala generna stängs av dör fostret
Patientfall 3; DNA (MLPA) Length (nt) SALSA MLPA probe Gene / Exon Results % MLPA visar homozygot deletion över båda alfagenerna 236 178 382 364 346 292 318 184 373 201 4913-L1316 4799-L4797 4800-L4175 4926-L4017 4622-L4001 4624-L4004 4625-L4005 4637-L4018 8488-L8410 4627-L4007 POLR3K gene HS-40 HS-40 9.3 kb upstream HBZ 3.5 kb upstream HBZ Between HBZ & HBZP Between HBZ & HBZP Between HBA2P & HBA1P Between HBA1P & HBA2 Between HBA1P & HBA2 100 101 102 101 96 95 100 0 0 0 214 8492-L8415 Between HBA1P & HBA2 0 229 4628-L4008 Between HBA1P & HBA2 0 Homozygot SEA 142 160 240 4630-L4011 8498-L8422 4633-L6249 HBA1+2, exon 1 HBA2 intron 2a HBA2 intron 2b 0 0 0 -- SEA /-- SEA 166 136 196 4632-L6292 S0290-L9493 8491-L8414 HBA1+2 exon 3 Constant spring mutation End of HBA2 exon 3 0 0 0 190 4626-L4740 Between HBA2 & HBA1 0 220 8493-L8416 Between HBA2 & HBA1 0 256 8494-L8417 Between HBA2 & HBA1 0 339 8497-L8420 Between HBA2 & HBA1 0 154 8499-L8423 0.2 kb downstream HBA1 0 283 4638-L4019 0.5 kb downstream HBA1 0 310 4639-L4020 2.4 kb downstream HBA1 0 3.7 kb downstream HBA1
Patientfall 3; DNA Homozygot SEA A a -- SEA /-- SEA Mor; A AA Aa Lätt anemisk och mikrocytär a Aa aa heterozygot SEA αα/-- SEA
Varför är diagnos viktig? Anlagsbärare kan vara relativt symtomfria A A AA a Aa Men deras barn kan få anlaget i dubbel uppsättning och bli väldigt sjuka a Aa aa
Beställning Remiss Hemoglobinfraktionering
Vår analysstrategier Hematologi Hb, MCH (debiteras ej) Screen HPLC (inkl HBA2 och HbF), Gel/IEF Här svaras ca hälften av patienterna ut Resten till DNA (ca 50% av proverna)
Hemoglobinopati; internremiss för DNA-analys Vad letar vi efter? Kryssrutor fylls i för att vägleda DNA-svar
Vad letar vi efter? β-lokus/non-α lokus SNP, (mindre deletioner) Större deletioner/fusionsgener α-lokus 75%, deletioner 25%, icke del/snp
Man hittar det man letar efter Anamnes Frågeställning Urvalskriterier för diagnostik Rätt analysmetodik
HEMOGLOBINOPATI Metoderna Camilla Valtonen-André 2011-11-09
Man hittar det man letar efter Anamnes Ofta ingen alls! Frågeställning Oklar Urvalskriterier för diagnostik Rätt analysmetodik
Beställning Remiss Hemoglobinfraktionering
Vår analysstrategier Hematologi Hb, MCH (debiteras ej) Screen HPLC (inkl HBA2 och HbF), Gel/IEF Här svaras ca hälften av patienterna ut Resten till DNA (ca 50% av proverna)
Hemoglobinopati; internremiss för DNA-analys Anamnes och screenfynd Kryssrutor fylls i för analysval MLPA alfalokus Sekvens HBA2 och HBA1 MLPA non-alfalokus Sekvens HBB Sekvens HBG1 och HBG2 Riktad sekvens DNA-svar
Vad letar vi efter? β-lokus/non-α lokus SNP, (mindre deletioner) Sekvens (HBB och HBG1/HBG2 prom) Större deletioner/fusionsgener MLPA (Gel/DK) α-lokus 75%, deletioner MLPA (Gel/DK) 25%, icke del/snp Sekvens (HBA1 och HBA2)
Metoderna Sekvens Gel/Gap-PCR MLPA Detection of Chr X copy number X Male Female Triple X 283 bp 346 bp MRC-Holland b.v.
MLPA Deletionsdiagnostik med MLPA Multiplex Ligation-Dependent Probe Amplification Denaturering Hybridisering Ligering Amplifiering Detektion Detection of Chr X copy number X Male Female Triple X 283 bp 346 bp MRC-Holland b.v.
MLPA-analys
MLPA Length (nt) SALSA MLPA probe Gene / Exon Results % 236 4913-L1316 POLR3K gene 100 178 4799-L4797 HS-40 101 Map-order 382 364 346 4800-L4175 4926-L4017 4622-L4001 HS-40 9.3 kb upstream HBZ 3.5 kb upstream HBZ 102 101 96 292 4624-L4004 Between HBZ & HBZP 95 318 4625-L4005 Between HBZ & HBZP 100 3.7 del (αα/-α 3.7 ) 184 373 201 4637-L4018 8488-L8410 4627-L4007 Between HBA2P & HBA1P Between HBA1P & HBA2 Between HBA1P & HBA2 106 99 101 214 8492-L8415 Between HBA1P & HBA2 99 229 4628-L4008 Between HBA1P & HBA2 102 142 4630-L4011 HBA1+2, exon 1 78 160 8498-L8422 HBA2 intron 2a 74 240 4633-L6249 HBA2 intron 2b 59 166 4632-L6292 HBA1+2 exon 3 50 136 S0290-L9493 Constant spring mutation -1 196 8491-L8414 End of HBA2 exon 3 58 190 4626-L4740 Between HBA2 & HBA1 49 220 8493-L8416 Between HBA2 & HBA1 50 256 8494-L8417 Between HBA2 & HBA1 50 339 8497-L8420 Between HBA2 & HBA1 59 154 8499-L8423 0.2 kb downstream HBA1 105 283 4638-L4019 0.5 kb downstream HBA1 100 310 4639-L4020 2.4 kb downstream HBA1 102 3.7 kb downstream HBA1
Utvärdering 1 febr-31 juli 2011 Urvalskriterier för DNA-analys MCH < 27 pg (litteratur) HbA2 > 3,3% (Malmös ref.intervall) Avvikande topp i kromatogram (HPLC, Biorad Variant II) Avvikande band på IEF Familjeutredning, graviditet, önskemål på remiss + annan klinisk uppgift
Resultat 2010 2011 MLPA alfa positiva Sekv.HBA2 positiva Sekv.HBA1 positiva MLPA beta positiva Sekv.HBB positiva HB-fraktionering; 6 mån 624 682 Totalt DNA; 6 mån 190 412 (60%) DNA-alfa; 6 mån 2011 412 (60%) 98 30 6 DNA-beta; 6 mån 2011 174 (26%) 135 DNA-gamma; 6 mån 2011 15 (6%)
Resultat ALFA Om bara MLPA (eller gel) utan sekvens hade körts 36 alfa-talassemier missade 6 ofullständigt karakteriserade alfa-talassemier svar (dvs. compound del/mutation hade missats) 33% (42 av 128) hade missats/blivit ofullständiga Konklusion; Stort värde av att kombinera sekvens och MLPA BETA 18 % av de som misstänktes ha beta-talassemi eller beta-variant hade samtidigt alfa-talassemi, anti 3.7 eller en alfa-variant Konklusion; Viktigt att köra alfa-diagnostik i kombination med beta.