Antitrombin-Labmetoder. Karin Strandberg Klinisk kemi, Malmö Laboratoriemedicin, Skåne

Antitrombin-Labmetoder Karin Strandberg Klinisk kemi, Malmö Laboratoriemedicin, Skåne

Antitrombin Funktion/ Betydelse Metoder för diagnostik/skillnader Användning i diagnostik av ärftlig brist Provtagning/provhantering

Koagulation FIX FIX FIXa FVIIIa Aktiverad Trombocyt 2 FX FXa FVa TF FVIIa 1 TF presenterandecell FX Protrombin Trombin Trombocyt

Antikoagulation APC TFPI FIX Antitrombin FIX FIXa FVIIIa Aktiverad Trombocyt 2 FX FXa FVa TF FVIIa 1 TF presenterandecell FX Protrombin Thrombin APC Trombocyt

Antitrombin-Syntes/Elimination: Syntes: levern 58kDa, 0,13 g/l Halveringstid 2-3 dagar Elimination: levern, (via LDL-related protein receptor) SERPIN-struktur:

Huntington, JA TRENDS in Biochemical Sciences 2006 Antitrombin-Funktion: SERPIN-mekanismen

Antitrombin-Funktion AT-Pentackarid-fIXa komplex FIXa Antitrombin Antitrombin Pentasackarid Johnson D J D et al. PNAS 2010;107:645-650

Antitrombin-Funktion AT-heparin-fIXa komplex Johnson D J D et al. PNAS 2010;107:645-650

Antitrombin-Funktion Heparineffekt in vivo AntiTrombin Heparansulfat Endotel Efter skada större pool heparansulfat tillgänglig!

Antitrombin-Betydelse: Förvärvad brist Konsumtion vid sepsis, DIC, trombos, långvarig heparin-behandling Leversjukdom-nedsatt syntes Nefrotiskt syndrom-förlust i njuren

Antitrombin-Mutationer/Ärftlig brist: Genen: Heparin bindning Reaktiva sitet: Prevalens ärftlig brist i populationen: 0,1% I trombospopulation: 1-2% Antithrombin mutation database www1.imperial.ac.uk

Antitrombin-Mutationer/Ärftlig brist: Heparin bindning Reaktiva sitet: Typ av defekt Typ I Typ IIa Typ IIb Typ IIc Typ IIb Lokalisation av mutationen Varierar Reaktiva sitet Heparinbindande domänen Nära reaktiva sitet Typ IIa och IIc En del mutationer i homozygot form förenliga med liv, andra inte. Heterozygot brist ger ca. 50% aktivitet.

Labmetoder och klassifikation av AT-brist: Typ av defekt Typ I Typ IIa (Reaktiva sitet) Typ IIb (Heparin bindande sitet) Typ IIc ( nära reaktiva sitet) Kvalitativ, funktionell metod Heparincofaktor- Progressiv AT aktivitet AT aktivitet (heparin i metoden) (utan heparin) Normalt Kvantitativ metod AT antigen metod Ofta normalt Ofta normalt Normalt eller subnormalt

Labutredning-AT brist Heparin kofaktor aktivitet 0,80 kie/l AT brist exkluderad < 0,80 kie/l Uteslut förvärvad orsak Upprepad provtagning! Återigen 0,70-0,80 kie/l AT-brist? Endast gentest kan påvisa Återigen 0,70 kie/l AT-brist, familjestudier kan vara till hjälp! AT antigen Diff mellan typ I och II brist Progressiv AT aktivitet Diff mellan typ II brister Ref. Muszbek L et al Clin Chem Lab Med 2010

Rekommenderat val av antitrombin analyser vid diagnostik av ärftlig brist 3/ Mutationsdiagnostik 2/ Immunologisk, antigen bestämning 1/ Funktionell aktivitet

Rekommenderat val av antitrombin analyser vid diagnostik av ärftlig brist-mätprinciper 3/ DNA-sekvensanalys Mutationsdiagnostik 2/ Immunologisk, antigen bestämning 1/ Funktionell aktivitet Antikroppsbaserad, bestämmer koncentration Heparin kofaktor aktivitet med bovint trombin eller FXa

Mätprincip: Antitrombin heparin kofaktor metod med kromogent substrat Patientplasma AT Test Heparin + FXa/FIIa (överskott) [AT Heparin FXa/FIIa] + FXa/FIIa (återstående) Kromogent substrat FXa/FIIa (återstående) Peptid+pNA FXa/FIIa

Absorbans (mod/min) Funktionella substratmetoder Standardkurva med spädd normalplasma Kalibrering med IS Provets OD/min avläses på kurvan Antitrombin aktivitet (kie/l)

Metoder i EQUALIS-program? Inhibition av bovint FIIa- NPU 21558: Berichrom AT III (Siemens) Stachrom AT III (Stago, Triolab) Antithrombin III (Roche) Inhibition av bovint FXa- NPU 21557: Antitrombin IL (ILS) Coamatic AT 400 (Chromogenix, Haemochrom) Coamatic LR AT (Chromogenix, Haemochrom) DG-CHROM AT (Grifols, Medinor) Innovance Antitrombin (Siemens) Totalt 45 deltagare har funktionell metod!

Funktionell antitrombin aktivitet Funktionella antitrombin analyser -Jämförelse IIa/Xa baserad Heparin kofaktor aktivitet med bovint FIIa Heparin kofaktor aktivitet med FXa De flesta Typ I och II defekter detekteras De flesta Typ I och II defekter detekteras Trombin-hämmare påverkar FXa-hämmare påverkar Antitrombin Cambridge II missas

Antitrombin (kie/l) DABIGATRAN RESULTAT: Antitrombin Xa-baserad Berichrom AT Dabigatran (ng/ml) Antitrombinreagens baserade på trombin överskattar koncentrationen medan Xa-baserade metoder är opåverkade. Andreas Hillarp, 091211

Antitrombin (kie/l) 1,60 1,40 RIVAROXABAN RESULTAT: Antitrombin Xa-baserad 1,20 1,00 0,80 0,60 0,40 Stago Berichrom AT Chromogenix 0,20 0,00 0 200 400 600 800 1000 1200 Rivaroxaban (ng/ml) Antitrombinreagens baserad på faktor Xa överskattar koncentrationen medan trombin-baserade metoder är opåverkade. Andreas Hillarp, 091211

Funktionella antitrombin analyser -Jämförelse IIa/Xa baserad på prov heterozygot AT Cambridge II (A384S) Humant IIa-baserat Bovint Iia-baserat Faktor Xa-baserat Ur: Quality in Laboratory Hemostasis and Thrombosis Ed. Kitchen S et al 2009

Funktionella antitrombin analyser -Fler skillnader IIa/Xa baserad? Skillnader i inkubationstid (prov+reagens), typ och konc. av heparin kan påverka resultatet vid mutationer i heparin-bindande site. Bovint IIa och Xa-metoder har sensitivitet nära 100%

! Behövs mer än ett test? Falskt högt? Falskt lågt? Ref. Khor B, van Cott E; Am J Hematol 2010

Funktionella antitrombin analyser -Kvalitetsmål? Inom-batch variation: 2% CV Inom-lab variation: 5% CV Deltagande i externt kvalitetsäkringsprogram rekommenderas! Ref. Muszbek L et al Clin Chem Lab Med 2010

CV (%) Funktionella antitrombin analyser -Jämförelse av kvalitet IIa/Xa- baserad 20 18 16 14 12 10 8 6 4 2 0 1 2 3 4 5 6 7 ECAT-utskick 2009-2010 IIa (ca 270) Xa (ca 100)

Tolkning av resultat? Diagnostiska dilemmat? Referensintervall AT-aktivitet: 0,80-1,20 kie/l Värden mellan 0,70-0,80 svårvärderade. 0,80 har accepterats som nedre gränsen för ref. områdesintervallet.

Patienter jämförda med olika antitrombin-metoder-2009-12-01 Tolkning? Patient Berichrom AT (IIa) Stachrom AT, Gbg (IIa) Coamatic LR AT, Gbg (Xa) AT ILS, Hbg (Xa) Tidigare resultat AT, Mö Diagnos? 1-f.78 0,87 (Gbg) 0,62 0,68 0,71 (2009) (Berichrom) 2-f.69 0,72 (Gbg) 0,57 0,63 0,57, 0,65, 0,74 (2009) (Berichrom) Bristare? Bristare? 3-f.66 0,74 (Mö) 0,45 Bristare?

Patienter jämförda med olika antitrombin-metoder-2009-12-01 forts. Patient Berichrom AT, (IIa) Stachrom AT, Gbg (IIa) Coamatic LR AT, Gbg (Xa) AT ILS, Hbg (Xa) Tidigare resultat AT Mö Diagnos? 1-f.78 0,87 (Gbg) 0,62 0,68 0,71 ( 0901, gravid) 2-f.69 0,72 (Gbg) 0,57 0,63 0,52 (90-talet, diagnos) 0,65, 0,74, 0,57 (2009) 3-f.66 0,74 (Mö) 0,45 0,40-0,50 (80-talet, diagnos) Hereditet för DVT, pat. utredd -97, heterozygot APC-resistens Hereditet för AT-brist, diagnos AT-brist pat. sinustrombos postpartum 2007, därefter Waranbeh. DVT+PE 16 år gammal (rökning + p-piller), diagnos AT-brist, retrombos+axillaris trombos 20-års ålder

Barn Frisk fullgånget barn: Kan ha ner till 50% av vuxens värde Antar vuxenvärden efter 6 mån ålder (enl. Andrews M 1990)

Provtagning-provhantering-CLSI Trombocytfattig plasma (<10 x 10 9 /L) Förvaring -20 C upp till 4 mån Provtagning tidigast 3 mån efter trombosinsjuknande AVK-behandling Heparin-behandling Figurer: Daniel Mauritzson

Summering-Funktion/Betydelse: AT=SERPIN: inaktiverar serin proteaser Aktiviteten accelereras av heparin Heparinbindande och trombinbindande regioner Förvärvad och ärftlig brist, assoc. med trombosrisk AntiTrombin

Summering-Metoder: 3/ Mutationsdiagnostik 2/ Immunologisk, antigen bestämning 1/ Funktionell aktivitet

Kommande publikation i Läkartidningen: Ärftlig antitrombinbrist-en sällsynt men allvarlig trombospredisponerande förändring Bremme K, Petrini P, Sallamba M, Tengborn L Tack till Lilian Tengborn!