Författare: Ulrika Aronsson. Vårterminen Examensarbete: Grundnivå (G2E), 15 högskolepoäng. Huvudområde: Biomedicinsk laboratorievetenskap

Metodutvärdering och mervärde av Treponema pallidum IgM analys vid diagnostik av syfilis Method evaluation and the additionally value of Treponema pallidum IgM analysis in syphilis diagnostics Författare: Ulrika Aronsson Vårterminen 208 Examensarbete: Grundnivå (G2E), 5 högskolepoäng Huvudområde: Biomedicinsk laboratorievetenskap Biomedicinska analytikerprogrammet, inriktning laboratoriemedicin BMLV, Examensarbete, 5 högskolepoäng Institutionen för hälsovetenskaper, Örebro universitet. Handledare: Kerstin Malm, Biomedicinsk analytiker och PhD, Örebro univsersitetssjukhus Examinator: Malin Prenkert, lektor, Örebro universitet

Abstrakt Treponema pallidum (T.pallidum) är en bakterie som orsakar infektionssjukdomen syfilis och som har människan som värdorganism. T. pallidum är huvudsakligen sexuellt överförbar men kan även överföras från blodgivare till blodtagare samt från mor till foster. I ett tidigt skede i syfilisinfektionen kan ett serologiskt immunglobulin M (IgM) test, som enbart detekterar treponemalt IgM, påvisa om det föreligger en tidig syfilisinfektion med möjlighet att starta behandling i ett tidigare skede och att diagnostisera kongenital syfilis, eftersom IgM inte passerar placenta. Syftet med studien var att göra en metodutvärdering av Syphilis Vircilia IgM Monotest test genom att jämföra resultat från Recomwell Treponema IgM samt att utvärdera om testet kan tillföra ytterligare information eller användas som komplement i diagnostik av tidig syfilisinfektion. I metodjämförelsen ingick 37/94 prover med diagnostiserad syfilis medan övriga 56/94 prover, indelade i nylig, utläkt och ospecifik reaktivitet för syfilis, enbart analyserades med Syphilis Virclia IgM Monotest. Resultatet av studien visade att sensitiviteten för Syphilis Virclia IgM Monotest kunde beräknas till 54% samt att ett mervärde av testet var svårt att utvärdera på grund av låg sensitivitet samt avsaknad av klinisk information. Slutsatsen av studien var att sensitiviteten beräknades till 54% för Syphilis Virclia IgM Monotest samt att testet och dess mervärde ytterligare behöver utvärderas med väldokumenterad klinisk information hos provmaterialet och kongenitala patienter för att kunna avgöra den framtida användningen av testet. Nyckelord: Treponema pallidum, Syfilis, kemiluminescens, ELISA, serologi, antikroppar

Abstract Treponema pallidum (T. pallidum) is a bacteria causing the infectious disease called syphilis in humans. The transmission of T. pallidum is mainly caused by sexual contact but may also be transmitted via blood donors to blood receivers or to fetus during pregnancy. In an early event of the infectious disease a serological test detecting only treponemal immunoglobulin M (IgM) antibodies can be used to determine a newly transmitted infection which is useful due to the benefits of early treatment and the diagnosis of congential syphilis, since IgM does not cross the placenta. The aim of this study was to evaluate the performance Syhilis Virclia IgM Monotest in comparison to Recomwell Treponema IgM and to evaluate if the test can conduce additionally information or be used as a complement in the diagnosis of early syphilis. Totally 37/94 samples diagnosed with syphilis were used in the evaluation of the tests whilst the remaining 56/94 samples, divided in newly, treated and nonspecific reaction of syphilis, only were tested with the Syphilis Virclia IgM Monotest. The results of this study showed that the Syfilis Virclia IgM Monotest was estimated to a sensitivity of 54% and the additionally information of the test was difficult to interpret due to the lack of sensitivity and clinical information. The conclusion of this study was that the analytical sensitivity of Syphilis Virclia IgM Monotest was 54% and that the test in itself and its additionally information needed to be further investigated, with congenital patients and well-documented clinical data, in order to determine the future clinical usefulness of this test. Keywords: Treponema pallidum, Syphilis, chemiluminiscence, ELISA, serology, antibodies

INNEHÅLLSFÖRTECKNING INTRODUKTION... - MIKROORGANISMEN TREPONEMA PALLIDUM... STADIER VID SYFILISINFEKTION...2 PREVENTION OCH BEHANDLING.3 UTBROTT I VÄRLDEN..4 UTBROTT I SVERIGE.5 DIAGNOSTIK AV SYFILIS.6 ARCHITECHT SYPHILIS TP (ABBOT DIAGNOSTICS, WEISBADEN, GERMANY).7 RPR: MACRO-VUE TM RPR CARD TEST (BECTON DICKINSON MICROBIOLOGY SYSTEMS, MARYLAND, USA).. 8 TPPA: SERODIA -TPPA (FUJIREBIO, TOKYO, JAPAN)...9 SYPHILIS VIRCLIA IGM MONOTEST (VIRCELL MICROBIOLOGISTS, GRANDA, SPANIEN).0 RECOMWELL TREPONEMA IGM (MIKROGEN, NEURID, GERMANY)..0 SYFTE. MATERIAL OCH METOD... -3 PROVMATERIAL... TESTKIT: SYPHILIS VIRCLIA IGM... 2 ETIKPRÖVNING 3 RESULTATBEARBETNING..3 RESULTAT... 3-8 PROVER FRÅN GÖTEBORG OCH GUINEA-BISSAU... 3 PROVER FRÅN ÖREBRO...8 DISKUSSION... 20-25 PROVER FRÅN ÖREBRO OCH GUINEA-BISSAU..20 PROVER FRÅN ÖREBRO 22 SYPHIHLIS VIRCLIA IGM MONOTEST.24 SLUTSATS 25 TACK 25 REFERENSER... 26-28

Introduktion Mikroorganismen Treponema pallidum Syfilis, tidigare kallad lues, är en infektionssjukdom och orsakas av bakterien Treponema pallidum (T. pallidum) som är en spiralformad spiroket. Smittan är i huvudsak sexuellt överförbar via skadad eller intakt hud och slemhinnor men kan även överföras från blodgivare till blodtagare samt från mor till foster via placenta under en pågående syfilisinfektion. T. pallidum har människan som värdorganism och dess känslighet för uttorkning gör att den dör utanför kroppen. Mikroorganismen är obligat anaerob och går inte att odla på artificiella medier in vitro. Generationstiden för bakterien är cirka 24-30 timmar och medför att inkubationstiden, från ett smittotillfälle till att de första symtomen uppstår, är mellan två till sex veckor lång (). Förmågan hos T.pallidum att undgå immunförsvaret innebär att den slutligen kan ge upphov till kroniska tillstånd. För att försvåra fagocytos kan mikroorganismen bekläda sig med värdorganismens fibronektin men det kan också förekomma antigenvariation inom populationen (). T. pallidum har även ett lågt innehåll av proteiner på sitt yttermembran vilket kan minska reaktiviteten hos värdorganismens antikroppar och celler i immunförsvaret (2). Mikroorganismen saknar produktion av toxiska proteiner varför de flesta vävnadsskador och andra symtom som relateras till syfilisinfektion beror på aktivering av värdorganismens immunologiska och inflammatoriska respons (3). T. pallidum orsakar cell- och vävnadsdestruktion genom att cirkulerande immunkomlex med olika antigen från mikroorganismen inducerar inflammation hos värdorganismen (). Treponemala antigen är bland annat membranlipoproteinerna TpN5, TpN7 och TpN47 (4). Både TpN7 och TpN47 leder till immunologisk respons som resulterar i en hög titer av antikroppar (3).

Stadier vid syfilisinfektion Syfilisinfektionen kan delas in i olika stadier; primär, sekundär, latent respektive tertiärt stadie. Det primära stadiet karaktäriseras av ett smärtfritt sår, ibland kallat schanker, lokalt vid inokulationsstället. Såret innehåller ett växande antal T. pallidum och uppkommer cirka tre till sex veckor efter en initial infektion (3). Uppkomst av kliniska manifestationer kräver en hög koncentration av mikroorganismen i kroppens vävnader (). Inom tre till åtta veckor självläker såret medan bakterien sprids via blodcirkulationen till kroppens olika organ vilket utgör övergången till ett sekundärt stadie. I samtliga stadier i syfilisinfektionen kvarstår sedan bakteriemin eftersom bakterien intermittent förökar sig i blodet. Bakteriemin möjliggör att T. pallidum kan överföras till ett foster under graviditet (3). Det sekundära stadiet uppkommer inom tre månader från den initiala infektionen (3). Ett sekundärt stadie karaktäriseras vanligen av makulopapillära utslag i huden medan övriga symtom bland annat kan vara muskelvärk, meningit, viktminskning eller inflammation i munnens och genitaliernas mukösa vävnader (5,6). Det sekundära stadiet kan självläka spontant efter varierande lång tid men om behandling uteblir kommer övergång till ett latent stadie ske (). I ett latent stadie kan bakterien dock finnas i kroppens olika vävnader utan att ge några kliniska symtom. En sexuellt överförbar infektion blir allt mer ovanlig efter övergången till ett latent stadie. En tredjedel av obehandlade patienter i ett latent stadie utvecklar tertiär syfilis som uppkommer år eller årtionden efter en initial infektion (3). Ett tertiärt stadie karaktäriseras av skador i centrala nervsystemet (CNS) vilket även kallas neurosyfilis men skador sker även kardiovaskulärt eller yttrar sig som granulom i t.ex. hud, ben och lever (). Neurosyfilis kan förutom i ett tertiärt stadie även uppkomma dagar eller veckor efter initial infektion. Symtom vid neurosyfilis är bland annat förändringar i hörsel, syn, försvagning i ansiktets muskler och meningit. Neurosyfilis påverkar cerebrospinalvätskans sammansättning genom att till exempel öka innehållet av proteiner och vita blodkroppar (3). 2

Prevention och behandling För att förebygga smittöverföring från en blodgivare till en blodtagare tas ett blodprov från varje ny blodgivare som undersöks med sållningstester. I sållningstesterna ingår analyser av markörer för följande smittämnen: T. pallidum, humant immunbristvirus (HIV) -2, Hepatit B, Hepatit C, Humant T-lymfotropt virus (HTLV) I-II. Vid varje blodgivning utförs alltid sållningstester men även en hälsodeklaration samt en kompletterande intervju, vilka utgör ett viktigt komplement vid tolkning av sållningstesternas resultat (7). En syfilisinfektion kan överföras från moder till foster genom att bakterien T. Pallidum passivt överförs med blodet via placenta under en graviditet (,8). Kongenital syfilis ger bland annat upphov till foster eller spädbarnsdöd men orsakar även multiorganiska infektioner (9). Infektionen kan exempelvis medföra skador på tänder, ben men även leda dövhet och neurosyfilis mm (0). Överföring av en syfilisinfektion uppskattas till ca 60-00% under det primära- och sekundära stadiet, 40-83% i ett tidig latent stadie samt <0% i ett sent latent stadie vid en pågående graviditet (). Enligt socialstyrelsens föreskrifter ska vårdgivaren erbjuda provtagning hos alla gravida kvinnor för analys av T. pallidum, HIV I-II och Hepatit B (2). Vid tidig diagnostik av syfilisinfektion och vid behandling insatt i ett så tidigt skede som möjligt under en graviditet ökar preventionen för medfödd syfilis (3,4). Förutom hos mödrar som fått reaktivitet i serologiska tester för diagnostik av syfilisinfektion kan även deras nyfödda spädbarn få reaktivitet i motsvarande tester oavsett om de blivit infekterade eller inte. Reaktivitet i testen beror på att treponemala antikroppar av immunglobulin G (IgG) klass passivt kan överföras via placenta från moder till foster. Däremot kan treponemala antikroppar av immunglobulin M (IgM) klass inte överföras (5). Hos antikroppar av IgG klass utgörs uppbyggnaden av monomera enheter till skillnad från IgM vars uppbyggnad utgörs av pentamera enheter och därav kan IgM inte passera placenta (6). Detektion av en kongenital syfilisinfektion hos ett spädbarn sker vid påvisande av treponemala IgM antikroppar vars ursprung kommer från fetal antikroppsproduktion (7). Enligt smittskyddslagen klassificeras syfilis som en allmänfarlig och anmälningspliktig sjukdom och ska därför anmälas till landstingets smittskyddsläkare och folkhälsomyndigheten (8). För att förhindra smittspridning krävs tidig och adekvat behandling. Idag finns det inget vaccin som kan förebygga en syfilisinfektion däremot kan en sådan infektion behandlas med antibiotika. I första hand ordineras Benzathine penicillin G som kan användas vid behandling 3

av samtliga stadier av syfilis (9,20). För att skydda sig mot syfilis kan kondom användas som preventivmedel. Under en pågående behandling bör den som har en syfilisinfektion avstå från samlag till dess att ett negativt kontrollprov finns att tillgå (8). Utbrott i världen Enligt World Health Organization (WHO) uppskattades antalet nya fall av syfilisinfektion år 2008 vara 0,6 miljoner hos människor i åldrarna 5-49 år (2). I en rapport gjord av European Centre for Disease Prevention and Control (ECDC) har det hos 29 länder inom Europeiska Unionen (EU)/European Economic Area (EEA) rapporterats totalt 24 54 fall av syfilisinfektion år 204. Bland 9/29 länder rapporterade bland annat Norge, Finland, Danmark och Tyskland även information om ursprunget av överföringen av syfilisinfektionen hos 60% av fallen. Dessa 60% utgjordes av sammanlagt 7 48 fall och bland dessa var ursprunget 62% hos män som haft sex med män (MSM), 5% av heterosexuella män, 9% av heterosexuella kvinnor medan 4% var av okänt ursprung (figur )(22). Figur. Procentuell fördelning av syfilisinfektioner hos 7 48 fall med dess kategoriserade fördelning av överföringsursprung och kön. Data insamlat från: Danmark, Finland, Frankrike, Tyskland, Grekland, Island, Irland, Malta, Nederländerna, Norge, Portugal, Rumänien, Slovakien, Slovenien, Sverige, Storbritannien, Litauen, Tjeckien och Lettland. Män som haft sex med män (MSM)(22). 4

Utbrott i Sverige Syfilis blev i slutet av 900-talet en allt mer sällsynt sjukdom i Sverige men under senare år har det skett en ökning av utbrott (8). År 206 rapporterades totalt 349 fall av syfilis varav 34 fall utgjordes av män respektive 35 fall av kvinnor, vilket visar på att det är vanligare med syfilis hos män än kvinnor. Av samtliga fall utgjordes 20 fall av primärt stadie, 66 fall av sekundärt stadie, 06 fall av tidigt latent stadie samt 57 fall där stadiet inte angavs eller var oklart. Hos 48% hade smittan ägt rum i Sverige medan 48% hade smittats utomlands och resterande 4% saknade information. Hos de män som var smittade med syfilis hade 78% blivit smittade vid sexuell kontakt med män. Män som har sex med män utgör även en ökad riskfaktor för HIV då överföringen av HIV underlättas i tidiga stadier vid en syfilisinfektion (23). Sammantaget har antalet rapporterade fall av syfilis per år i Sverige varierat över tid, med en uppåtgående trend mellan år 2000 och 206 (figur 2). Den årliga ökningen av syfilisfall mellan år 2009 och 205 var i genomsnitt 9% medan det från år 205 till 206 skedde en ökning med 6 % (23). Figur 2. Antal fall av syfilis rapporterade i Sverige per kön mellan år 2000 och 206. Bilden är tagen ifrån Folkhälsomyndighetens hemsida. (Bilden finns tillgänglig på: https://www.folkhalsomyndigheten.se/folkhalsorapportering-statistik/statistikdatabaser-ochvisualisering/sjukdomsstatistik/syfilis/?p=25380) 5

Diagnostik av syfilis Diagnostik av tidig primär syfilis kan vanligen detekteras med Ploymerase Chain Reaction (PCR) som direkt kan påvisa T pallidum från till exempel ett sår. Andra möjliga alternativ för direkt påvisning av bakterien är fluorescerande mikroskopi eller mörkfältsmikroskopi (24). Idag används rutinmässigt serologiska metoder för att detektera antikroppar i diagnostiken av samtliga stadier av syfilis (25). Generellt vid infektioner syntetiseras i ett första skede IgM antikroppar och övergår sedan till att producera IgG som i sin tur hämmar IgM syntesen (6). Vid serologisk analys av syfilis detekteras två grupper av antikroppar. Den ena gruppen utgörs av treponemala antikroppar, vilka är specifika för T. pallidum och finns i IgM- och IgG-klass (0). Ungefär två veckor efter initial infektion produceras treponemala IgM antikroppar och övergår efter cirka två veckor till produktion av enbart treponemala IgG antikroppar med samma specificitet (4). Detektion av treponemala antikroppar är möjlig efter cirka tre veckor (25). När treponemala IgG bildats börjar treponemala IgM antikroppar spontant att minska under en aktiv syfilisinfektion (26). Den andra gruppen av antikroppar består av non-treponemala antikroppar, som kallas reaginer (0). Dessa reaginer är en mix av både IgM- och IgG-klass. Detektion av non-treponemala antikroppar är möjlig efter cirka sex veckor efter en initial infektion (25). Serokonversion anger förloppet från ett infektionstillfälle, då patienten har avsaknad av antikroppar, tills ett senare skede efter infektionstillfället när antikroppar är påvisbara (27). 6

I den kliniska verksamheten i på Universitetssjukhuset Örebro analyseras blodprover från blodgivare samt patienter som misstänks ha en syfilisinfektion. Först utförs ett screeningtest med Architecht Syphilis TP för att skilja positiva prover från negativa prover. De reaktiva proverna från screeningen följs därefter upp av de två verifieringstesten Rapid plasma reagin och Treponema pallidum partikelagglutination. Testerna behöver kompletteras med klinisk information om patienten för att kunna säkerställa en diagnos. Architecht Syphilis TP (Abbot Diagnostics, Weisbaden, Germany) Initialt utförs screeningtest med Chemiluminescent Microparticle Immunoassay (CMIA) som grundar sig på en indirekt Ezyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) teknik. I en indirekt ELISA utgör reaktionsbrunnen en fast fas som är klädd med antigen (28). Metoden i en CMIA bygger istället på att magnetiska mikropartiklar utgör en fast fas som är klädda med rekombinanta T. pallidum antigen; TpN5, TpN7 och TpN47. Därefter tillsätts serum med eventuellt innehåll av treponemala antikroppar som kan binda till antigenen vid inkubering (29). Genom tillförsel av en magnet i ett efterföljande tvättsteg kvarstår primära antikroppar som bundit in till antigenen på de magnetiska mikropartiklarna (30). Därefter tillsätts och inkuberas sekundära antikroppar i form av akridiniumkonjugerat anti-humant IgM och IgG för att möjliggöra detektion av både antitreponemala IgM och IgG, följt av ett tvättsteg (29). Efter tillsats av väteperoxid och natriumhydroxid sker en reaktion med akridinium som ger upphov luminiscense genom kemiluminescens (3). Kemiluminescens är ett fenomen som uppkommer under påverkan av en kemisk reaktion som genererar emission av elektroner i form av ljus. Luminiscensen detekteras av en luminometer och används för att detektera antikroppar (28). 7

RPR: Macro-Vue TM RPR card test (Becton Dickinson Microbiology systems, Maryland, USA) Ett av verifieringstesten som utförs är rapid plasma reagin (RPR). I RPR detekteras reaginer som är non-treponemala antikroppar av både IgM och IgG klass (25). Reaginer är bland annat riktade mot kroppseget kardiolipin som exponeras i huden när såret bildas. Testet utförs på ett reaktionskort på vilket antigenet kardiolipin, kolpartiklar och serum tillsätts. Vid förekomst av reaginer uppkommer en flockningsreaktion som synliggörs av kolpartiklar för att underlätta avläsningen. Reagin är dock inte en specifik antikropp för att detektera T. pallidum utan kan även uppkomma vid andra sjukdomstillstånd t.ex. reumatisk feber, systemisk lupus erythematosus, hepatit eller vid graviditet (0). Ett positivt non-treponemalt test behöver därför kompletteras med ytterligare ett verifieringstest som riktar sig mot specifika antigen hos T.pallidum (25). RPR kan utföras både kvalitativt och kvantitativt där en kvantitativ RPR används vid behandlingsuppföljning. Non-treponemala antikroppar är därav markörer för en aktiv infektion (0). Behandlingsuppföljning görs efter tre, sex, 2 och eventuellt 24 månader (20). Titern för non-treponemala antikroppar vid en lyckad behandling sjunker vanligtvis fyrfaldigt och blir tillslut negativ i RPR (25). Titer anger högsta utspädning av serum där agglutination mellan antigen och antikropp synliggörs (6). Vid behandling av syfilis i senare stadier kan RPR förbli positivt i en låg titer (figur 3)(25). Figur 3. Serologisk reaktivitet i ett non-treponemalt test, rapid plasma reagin (RPR), hos obehandlade respektive behandlade patienter för samtliga stadier av syfilis (25). 8

TPPA: Serodia -TPPA (Fujirebio, Tokyo, Japan) Ett annat verifieringstest som också utförs kallas Treponema pallidum partikelagglutination (TPPA). TPPA är ett partikelagglutinationstest som är specifikt för antigenet T. pallidum där treponemala IgG och IgM-antikroppar detekteras. Testet utförs på en mikrotiterplatta där serum späds och därefter tillsätts gelatinpartiklar klädda med T. pallidum. Vid förekomst av treponemala IgG och IgM-antikroppar uppkommer agglutination som synliggörs i form av en tunn matta i botten av brunnen (0). Vid behandling av syfilis används inte en kvantitativ TPPA som behandlingsuppföljning då de som serokonverterat vanligtvis förblir positiva livet igenom trots en lyckad behandling (figur 4)(25). Figur 4. Serologisk reaktivitet i ett treponemalt test, Treponema pallidum partikelagglutination (TPPA), hos obehandlade respektive behandlade patienter för samtliga stadier av syfilis (25). Utöver verifieringstesterna vars detektion inte skiljer på treponemala och non-treponemala IgM och IgG antikroppar, kan komplettering av ett treponemalt IgM test detektera för de trepomnemala IgM antikropparna som börjar produceras i en tidig syfilisinfektion (25,4). I klinisk verksamhet används IgM tester från olika företag. Ett IgM test som nyligen kommit ut till försäljning, 206-09-0, är Syphilis Virclia IgM monotest. Ett annat IgM test är Recomwell Treponema IgM som idag är ett etablerat test i rutinverksamheten på Sahlgrenska Universitetssjukhuset vilket utgör Sveriges referenslaboratorie för att påvisa antitreponemala IgM antikroppar mot T. pallidum. 9

Syphilis Virclia IgM Monotest (Vircell microbiologists, Granda, Spanien) Testet kan både utföras manuellt och automatiserat. Testet grundas på indirekt kemiluminescens och baseras på principen för en indirekt ELISA teknik. I en indirekt ELISA är reaktionsbrunnen klädd med antigen (28). Reaktionsbrunnen i detta test är klätt med polystyrenkulor dit antigen är bundet och utgörs av både Treponema pallidum membraneprotein (Tpp) 7 respektive Tpp47. I ett första steg tillsätts anti-humant IgG till reaktionsbrunnen. Anti-humant IgG tillsätts för att undvika interferenser med treponemala IgG- antikroppar till reaktionsbrunnens antigen, för att säkerställa att i första hand treponemala IgM antikroppar binder till antigenen (32). I ett andra steg tillsätts sedan serum med innehåll av eventuella treponemala IgM- och IgG antikroppar som kan binda in till antigenen vid en inkubering. Inbundna primära antikroppar kommer i ett efterföljande tvättsteg kvarstå medan övriga antikroppar avlägsnas (28). Därefter tillsätts en sekundär peroxidaskonjugerad anti-human IgM antikropp och efter inkubation och ett ytterligare tvättsteg kommer obundna sekundära antikroppar att avlägsnas (32). Inbunden sekundär antikropp binder till Fc-delen hos primära humana antikroppar. Ett komplex bestående av antigen, primär antikropp och sekundär antikropp har i detta steg uppkommit (27). Slutligen tillsätts ett kemiluminescerande substrat i form av peroxid och luminol som i närvaro av peroxidaskomplexet ger en reaktion och genererar luminescence till följd av kemiluminescens. Luminiscensen mäts i Relative Light Units (RLU) och för att testet ska bli giltigt måste både positiv och negativ kontroll hamna inom specificerade gränser eftersom dessa värden används när patientprovets index räknas fram. Indexvärdet beräknas enligt följande: antikroppsindex = (Provets RLU/ kalibratorns RLU)(32). Recomwell Treponema IgM (Mikrogen, Neurid, Germany) Denna manuella metod baseras på en indirekt ELISA där brunnarna är klädda i de rekombinanta antigenen TP5, TP7,TP47 och TmpA. Serum tillsätts till brunnarna följt av inkubering och ett tvättsteg. Därefter tillsätts ett konjugat av peroxidaskonjugerade antihuman IgM antikroppar följt av inkubering och ett tvättsteg. Vid tillsats av tetramethylbenizidine (TMB), som utgör substratet som peroxidaset katalyserar, genereras ett färgomslag. Färgomslagsreaktionen stoppas när fosforsyra (H3PO4) tillsätts och slutligen belyses provet med 450 nanometer där absorbansen avläses med en spektrofotometer (33). 0

Syfte Syftet med denna studie är att göra en metodutvärdering på ett automatiserat Syphilis Vircilia IgM Monotest (Vircell microbiologists, Granda, Spanien) och jämföra resultat från de redan befintliga manuella IgM testen Recomwell Treponema IgM (Mikrogen, Neurid, Germany) samt att utvärdera om testet kan tillföra ytterligare information eller användas som komplement i diagnostik av en tidig syfilisinfektion. Material och metod Provmaterial Det totala antalet prover som analyserades var 93 stycken. Sammanlagt analyserades 56 prover från Örebro som var tagna mellan år 20 och 207. Urvalet av prover från Örebro valdes ut enligt följande kriterier: 4 stycken prover från patientgrupp med en aktuell syfilisinfektion och som troligtvis var nysmittade (aktuell/nysmitta), 22 stycken prover från patientgrupp med utläkt syfilis samt 20 stycken prover från patientgrupp som fått ospecifik reaktivitet i screening. I tillägg analyserades 22 anonymiserade prover från Göteborg som var tagna mellan år 205 och 208. Urvalskriterier av prover från Göteborg var patienter som blivit diagnostiserade med syfilis. Dessutom analyserades 5 anonymiserade prover från Guinea-Bissau som var tagna från år 989 till 995. Urvalskriterier från Guinea-Bissau var patienter som blivit diagnostiserade med syfilis. Samtliga prover förvarades frysta -20 C i väntan på analys.

Syphilis virclia IgM monotest (Vircell microbiologists, Granda, Spanien) I denna studie användes den automatiserade metoden för Syfilis Virclia IgM monotest och följdes enligt företagets anvisningar (32). I kittet ingick teststrips där vardera var avsett att användas för ett enskilt prov och förvarades i 2-8 C. Material som behövdes men som inte ingick i testkittet var virclia auxiliary reagents (Vircell microbiologists, Granda, Spanien) som innehåller Virclia washing solution 20X och färdigspädd Virclia decontamination solution. Samtliga reagenser, teststrips och provmaterial antog rumstemperatur innan användning. Washing solution med en koncentration av 20X späddes med MilliQ-vatten till X. Till instrumentet VirClia-chemiluminesence (Vircell, Parque Tecnológico de la Salud. Avicena 8, 806 Granda- Spanien) tillsattes decontamination solution och därefter initierades instrumentet med spädd washing solution. För varje körning kunde totalt 24 provrör med serum och tillhörande teststrip placeras på avsedd plats i instrumentet. Efter avslutad analys erhölls ett siffervärde med tre decimaler som utgör ett indexvärde. Programvaran Thunderbolt Strips GUI (Gold standard diagnostics, Davis, USA) anger om det erhålla indexvärdet är positivt, negativt eller ett resultat inom gränsvärdet. Testetstripset bestod av åtta testbrunnar (Brunn A-H). Brunn A-C utgjorde reaktionsbrunnar klädda med Treponema pallidum membraneprotein (Tpp)7 respektive Tpp47. En kalibrator från brunn F utgjorde en positiv kontroll av serum och tillsattes i brunn A, patientserum tillsattes i brunn B medan utspädd kalibrator, som utgjorde negativ kontroll, tillsattes i brunn C. Brunn D innehöll peroxidaskonjugerat anti-humant IgM, i brunn E fanns en inkubationsbuffert för serum- och kalibratorspädning bestående av fosfatbuffer och antihumant IgG. Samtliga brunnar D-F innehöll Neolone och Bronidox. Utöver detta fanns även brunn G som innehöll peroxid respektive brunn H innehållande luminol (32). 2

Etikprövning En etikprövning behövde inte göras eftersom analysen som utfördes redan genomförts tidigare, enligt ordination av läkare, men med andra metoder på provmaterial från positivt diagnostiserade patienter med syfilis eller konstaterade ospecifika prover. Syftet med den utförda analysen var att göra en metodutvärdering för att detektera för samma markörer, det vill säga antikroppar mot syfilis. Resultatbearbetning Utgångspunkten var att provresultat från det befintliga IgM-testet Recomwell Treponema IgM (Mikrogen, Neurid, Germany), var ett korrekt resultat. Sensitivitet beräknades enligt formeln: Sensitivitet = sant positiv/ (sant positiv + falskt negativ)(28). Resultatbearbetning utfördes i Excell 206 (Microsoft AB, Kista, Sverige). Resultat Prover från Göteborg och Guinea-Bissau Samtliga prover från Göteborg och Guiea-Bissau analyserades både med Recomwell Treponema IgM och Syphilis Virclia IgM Monotest. Vid jämförelse av indexvärden för de 37 analyserade proven från Göteborg och Guinea-Bissau blev totalt 7 positiva, 8 negativa och två prover hamnade inom gränsvärdet med analys av enbart Syphilis Virclia IgM monotest. Samtliga prover som låg inom gränsvärden analyserades ytterligare en gång och fick därmed utgöra det rapporterade resultatet (figur 5). 3

Indexvärden 7,5-7,6 7,3-7,4 6,9-7,0 6,7-6,8 6,5-6,6 6,3-6,4 6,-6,2 5,9-6,0 5,7-5,8 5,5-5,6 5,3-5,4 5,-5,2 4,9-5,0 4,7-4,8 4,5-4,6 4,2-4,3 4,0-4, 3,8-3,9 3,6-3,7 3,4-3,5 3,2-3,3 3,0-3, 2,7-2,8 2,5-2,6 2,3-2,4 2,-2,2,9-2,0,7-,8,5-,6,3-,4,-,2 0,8-0,9 0,6-0,7 0,4-0,5 0,2-0,3 0,0-0, 2 2 2 2 3 0 2 3 4 5 6 7 Antal patienter 4 4 6 Figur 5. Fördelning av indexvärden och dess frekvens hos 37 patienter från Göteborg och Guinea-Bissau vars serum analyserats med Syphilis virclia IgM monotest. Indexvärdet = provets Relative Light Units (RLU)/kalibratorns RLU. Indexvärden < 0,9 tolkas som negativt, 0,9-, utgör gränsvärdet och anses osäkert att bedöma och > tolkas som positivt. Röd stapel motsvarar negativa resultat, svart anger gränsvärde och blå anger positiva resultat. 4

Vid jämförelse mellan Recomwell Treponema IgM och Syphilis Virclia IgM Monotest var 4/37 prover positiva i båda testerna. Hos 4/37 prover gavs ett negativt resultat i båda metoderna. Av de 5/37 prover som i Recomwell Treponema IgM antog gränsvärde var 2/37 negativa i analys med Syphilis Virclia IgM Monotest, 2/37 var positiva och /37 gränsvärde (tabell ). För Recomwell Treponema IgM blev 2/37 prover positiva medan de med Syphilis Virclia IgM Monotest var negativa (figur 6). Hos 2/37 prover blev resultatet negativt vid analys av Recomwell Treponema IgM. Av dessa 2 prover var /37 positiv och /37 gränsvärde med Syphilis Virclia IgM Monotest (tabell ). Sammanfattningsvis hade 9/37 prover konkordanta resultat i båda testen medan 8/37 prover hade diskrepanta resultat. RPR och VDRL är likvärdiga tester som bygger på samma principer men med olika fabrikat. Fram till 204-05-3 värderades RPR enligt subjektiv bedömning av agglutination utan att späda prov och ange titer. Den subjektiva bedömningen av RPR kunde uppskattas till 3 och kategoriserades till stark reaktivitet respektive < 3 som motsvarade svag reaktivitet. Efter 204-06-0 värderades RPR med en titer baserat på spädning av provet. En titer i RPR som var >8 kategoriserades till stark reaktivitet och titer <8 motsvarade svag reaktivitet. VDRL titer >8 kategoriserades till stark reaktivitet medan en titer < 8 motsvarade svag reaktivitet. Av 37 prover var en negativ i TPPA medan 36 var positiva. Hos 5 prover med stark RPR/VDRL reaktivitet antogs resultatet positiv/gränsvärde/negativ enligt följande: Syphilis Vircila IgM Monotest var //3 medan Recomwell Treponema IgM var 0/4/. Hos de 5 prover som hade svag reaktivitet i RPR/VRDL var Syphilis Virclia IgM Monotest 6//8 medan Recomwell Treponema IgM var 0//4. Av de sju prover som var RPR/VDRL negativa var Syphilis Virclia IgM Monotest 0/0/7 medan Recomwell Treponema IgM.var 6/0/. Vid antagande att Recomwell Treponema IgM utgjorde gold standard kunde sensitiviteten beräknas till 54% för Syphilis Virclia IgM Monotest. Vid beräkningen av sensitiviteten uteslöts prover med gränsvärdesresultat. 5

Antal patienter Tabell. Resultat från två IgM metoder för serumprover från Göteborg och Guinea-Bissau som utreds för syfilis. Syphilis Virclia IgM Monotest Positiv Negativ Gränsvärde Total Recomwell Positiv 4 2-26 Treponema Negativ 4 6 IgM Gränsvärde 2 2 5.. Total 7 8 2 37. 6 5 5 4 3 3 3 2 Falskt negativa resultat 0 Index Figur 6. Fördelning av indexvärden hos 2 avvikande serumprov från Göteborg och Guinea- Bissau som analyserats med Syphilis Virclia IgM Monotest. Serumprov blev i Recomwell Treponema IgM positiva medan analys med Syphilis Virclia IgM Monotest gav negativt resultat. Indexvärdet = provets Relative Light Units (RLU)/kalibratorns RLU. Indexvärden < 0,9 tolkas som negativt. Indexvärdet för samtliga prover var inom range 0,24-0,68. 6

Tabell 2. Resultat av de två IgM metoderna hos patienter som utreds för aktuell syfilis Serumprov från Göteborg och Guinea-Bissau Metod n=37 (%) Syphilis Virclia IgM Monotest Positiv 7(46) Gränsvärde 2(5) Negativ 8(49) Recomwell Treponema IgM Positiv 26(70) Gränsvärde 5(4) Negativ 6(6) 7

Prover från Örebro Proverna från Örebro analyserades enbart med Syphilis Virclia IgM Monotest. Hos 4 patienter med en aktuell/nysmittad syfilisinfektion blev 7/4 positiva och resterande sju blev negativa (tabell 3). Dessa 4 var alla TPPA och RPR positiva. Hos de åtta med stark RPR reaktivitet antogs resultatet positiv/gränsvärde/negativ enligt följande: Syfilis virclia IgM monotest 6/0/2. Hos de sex med svag reaktivitet i RPR gav Syfilis Virclia Igm Monotest /0/5. Medianen för indexvärdet hos de med aktuell/nysmittad syfilisinfektion var,0395, range 0,062-3,764 (figur 7). Bland gruppen med 22 patienter diagnostiserade med utläkt syfilis 22/22 negativa i IgM testet (tabell 3). Av dessa 22 var alla TPPA positiva medan sju var RPR positiva och 5 stycken var RPR negativa. Hos de två proven med stark reaktivitet för RPR gav Syphilis virclia IgM monptest 0/0/2 medan de fem proven med svag RPR reaktivitet gav testet 0/0/5. Medianen för indexvärdet hos de med utläkt syfilis beräknades till 0,55, range 0,029-0,732 (figur 7). För gruppen med 20 patienter som var bedömda som ospecifik reaktivitet i screeningmetoden blev 20/20 negativa i IgM testet (tabell 3). Av dessa 20 var alla TPPA och RPR negativa. Medianen för indexvärdet hos de med ospecifik reaktivitet beräknades till 0,8, range 0,026-0,375 (figur 7). Tabell 3. Resultat för serumprover från Örebro som analyserats med Syphilis Virclia IgM Monotest Aktuell/nysmittad syfilis Utläkt syfilis Ospecifikt reaktiva Positiv 7 0 0 Negativ 7 22 20 Gränsvärde 0 0 0 Totalt 4 22 20 8

Indexvärden 3,8-3,9 3,7-3,8 3,6-3,7 3,5-3,6 3,4-3,5 3,3-3,4 3,2-3,3 3,-3,2 2,9-3,0 2,8-2,9 2,7-2,8 2,6-2,7 2,5-2,6 2,4-2,5 2,3-2,4 2,2-2,3 2,-2,2 2,0-2,,9-2,0,8-,9,7-,8,6-,7,5-,6,4-,5,3-,4,2-,3,-,2 0,9-, 0,8-0,9 0,7-0,8 0,6-0,7 0,5-0,6 0,4-0,5 0,3-0,4 0,2-0,3 0,-0,2 0-0, 2 2 4 4 0 2 4 6 8 0 5 Antal patienter 6 9 9 Ospecifik reaktivitet Utläkt syfilisinfektion Aktiv/nysmittad syfilisinfektion Figur 7. Fördelning av indexvärden och dess frekvens hos 56 patienter från Örebro vars serum analyserats med Syphilis Virclia IgM Monotest. Indexvärdet = provets Relative Light Units (RLU)/kalibratorns RLU. Indexvärden < 0,9 tolkas som negativt, 0,9-, utgör gränsvärdet och anses osäkert att bedöma och > tolkas som positivt. 9

Diskussion I denna studie genomfördes en utvärdering av SyphilsVirclia IgM monotest som ett komplement till RPR och TPPA vid misstanke om aktuell syfilisinfektion. I metodjämförelsen var det endast prover från Göteborg och Guinea Bissau som kunde utvärderas i avseende på sensitivitet då dessa prover analyserades med både Syfilis Virclia IgM monotest och Recomwell Treponema IgM. Proverna från Örebro analyserades däremot enbart med Syfilis Virclia IgM monotest. Prover från Göteborg och Guinea-Bissau Av provresultaten från Göteborg och Guinea-Bissau framgick att två av patienternas prover låg inom gränsvärdet med analys av Syphilis Vircila IgM Monotest (figur 5). För en av dessa patienter låg uppföljningsprovet även inom ett gränsvärde för Recomwell Treponema IgM. Patienten har vid en tidigare provtagning varit positiv för IgM i båda testerna. I detta fall kan troligtvis gränsvärdesreaktiviteten i uppföljningsprovet tyda på äkta IgM positivitet men då troligen i en situation där IgM -antikroppar börjat minska spontant alternativt att patienten blivit behandlad (26). Vid antagande att Recomwell Teponema IgM skulle vara positiv för IgM i uppföljningsprovet skulle detta inte bidra till ökad sensitivitet i Syfilis Virclia IgM Monotest eftersom testet inte skulle kunna detektera för gränsvärdesprovet som egentligen skulle blivit positivt. För det andra provet som låg inom gränsvärdet med analys av Syphilis Virclia IgM Monotest blev provet negativt för IgM vid analys med Recomwell Treponema IgM. För prover som saknar kliniska uppgifter och som ligger inom gränsvärden blir bedömningen av resultatet mer osäkert. I ett bra IgM test eftersträvas att positiva och negativa prover skiljer ut sig genom att hamna långt ifrån gränsvärdesintervallet för att säkerställa positivitet och negativitet hos prover. En testmetod med en hög gränsvärdesreaktivitet är svårbedömd. För att kunna utvärdera en metod för tidig syfilisdiagnostik på ett fullständigt sätt behövs detaljerade kliniska data. I denna studie fanns inte tillgång till dessa data varför fokuset i studien var att utvärdera den analytiska sensitiviteten för Syfilis virclia IgM monotest och hur testet eventuellt skulle kunna bidra i laboratoriets kliniska verksamhet. Syphilis Virlica IgM Monotest uppvisade i jämförelse med Recomwell Treponema IgM på proverna från Göteborg och Guinea-Bissau en sensitivitet på 54% (tabell ). Recomwell Treponema IgM antogs i denna studie att vara gold standard eftersom Sahlgrenska Universitetssjukhuset utgör 20

referenslaboratorium i Sverige med denna metod för att detektera treponemala IgM antikroppar. En kvarstående fråga är dock med vilken sannolikhet resultaten från Recomwell Treponema IgM är korrekta. Om en annan metod valts för att utgöra gold standard i denna studie hade sensitiviteten för Syphilis Virclia IgM Monotest sannolikt påverkats. Enligt en studie utförd av Sambri V et al. uppvisade Recomwell Treponema IgM en sensitivitet på 89,5% vid jämförelse med Syphilis Screening ELISA (Radmin, Rome Italy) och mikrohemagglutination testet MHA-TP (Fujirebio, Tokyo, Japan)(33). Enligt tabell stämmer 5% av provernas resultat överens mellan de båda testen medan 49% skiljer sig. Frågan är om det är svårt att mäta IgM eller att det alternativt kan tyda på att Syphilis virclia IgM monotest inte är så tillförlitligt. Merparten, 67%, av de provresultat som skiljer sig mellan testerna är positiva i Recomwell Treponema IgM medan dessa får ett negativt resultat i Syphilis virclia IgM monotest (tabell )(figur 6). I denna studie kunde inte någon säker korrelation mellan svag/stark eller negativ RPR/VDRL reaktivitet och korresponderande IgM positivitet styrkas. Sådana resultat är svårvärderade i avsaknad av kliniska data. I Recomwell Treponema IgM var 20/30 prover med RPR/VDRL reaktivitet även positiva för IgM och motsvarande reaktivitet gavs 7/30 prover för Syphilis Virclia IgM Monotest. Av sju RPR/VDRL negativa prover var sex positiva i Recomwell Treponema IgM medan ingen var positiv i Syphilis Virclia IgM Monotest. RPR används dels som en behandlingsmarkör som anger behandlingens effekt och används dels som markör för en aktiv infektion (0). Treponemalt IgM kan däremot användas för att detektera en tidig syfilisinfektion (25,4). Testerna är således inte helt jämförbara vilket komplicerar värderingen av korrelationen. Specificiteten för Syfilis virclia IgM monotest har inte utvärderats i denna studie eftersom ingen kontrollgrupp av negativa blodgivare analyserats vilket medför att det inte går att uttala sig med säkerhet om testets specificitet. Baserat på gruppen med ospecifik reaktivitet i screening hos patienter från Örebro, som samtliga var negativa för RPR och TPPA, kunde inte IgM reaktivitet påvisas hos någon av proverna (figur 6). Detta skulle hypotetiskt kunna tala för att specificiteten är relativt god för Syfilis virclia IgM monotest. 2

Prover från Örebro I den ursprungliga studiedesignen var proverna från Örebro utvalda för att utgöra testmateriel för att kunna se Syphilis Virclia IgM Monotest prestanda i den kliniska verksamheteten där testet var tänkt att introduceras. Förväntan inför denna studie var då att sensitiviteten för Syphilis Virclia IgM Monotest skulle motsvarat Recomwell Treponema IgM. Därför analyserades proverna från Örebro enbart med Syphilis Virclia IgM Monotest, vilket senare visade sig göra resultatet svårt att utvärdera. Syftet med proverna från Örebro var att värdera mervärdet av IgM testet i samband med misstänkt ny infektion samt vid misstänkt ospecifik reaktivitet i ett screeningtest för syfilis. Eftersom Syphilis Virclia IgM Monotest uppvisade en låg sensitivitet är nedanstående resultat svårvärderade. Hos samtliga prover från Örebro återfanns endast IgM positivitet bland gruppen med misstanke om aktuell/nysmittad syfilisinfektion. Hos denna grupp var det positiv reaktivitet i infektionsmarkören RPR men också i det specifika treponemala verifieringstestet TPPA. Hälften av dessa prover blev IgM positiva, vilket sannolikt skulle kunna tyda på en aktiv och eventuellt en nyligen tillkommen syfilisinfektion. Ett kompletterande IgM test tillför i detta sammanhang en säkrare bedömning av en syfilisinfektion. I den andra hälften av dessa prover blev IgM negativt vilket inte kan utesluta varken en tidig infektion eller patienter som haft sin syfilisinfektion länge, på grund av testets låga sensitivitet. Resterande grupper med utläkt syfilisinfektion och ospecifik reaktivitet i screeningen blev samtliga IgM negativa, vilket var förväntat. Hos de patienter med utläkt syfilisinfektion som var TPPA positiva och RPR negativa skulle det negativa IgM resultatet tala för att det inte är en aktiv syfilisinfektion. Hos de patienter som var TPPA och RPR positiva men där IgM blev negativt skulle detta hypotetiskt inte kunna utesluta en aktiv syfilisinfektion eftersom sensitiviteten för IgM testet är låg. För samtliga patienter med ospecifik reaktivitet i screeningen var alla TPPA, RPR och IgM negativa. Ett kompletterande IgM test skulle i detta sammanhang tillföra en säkrare bedömning som bekräftar ospecifick reaktivitet. Ytterligare utvärdering av Syphilis Virclia IgM Monotest med tillgång till kliniska data krävs för att säkerställa testets kliniska sensitivitet. 22

Dynamiken av treponemalt IgM är ännu inte helt känd gällande hur lång tid det tar för IgM att försvinna, men succesivt börjar treponemala IgM antikroppar att minska när syfilisinfektionen pågått under en tid (26). Utifrån studiens utgångspunkter var det delvis tänkt att IgM testet skulle kunna användas för att skilja nysmittade och de som varit smittade under en längre tid, men utifrån insamlad av bakgrundsinformation kan det vara tveksamt om IgM enbart utgör en markör för en tidig syfilisinfektion. Enligt två av varandra oberoende studier av Baker-Zander et al. respektive O Neill P et al. har det påvisats att treponemalt IgM återfanns hos obehandlade syfilispatienter inom primär, sekundär, tidig latent och sent latent stadie (34,35). Enligt dessa studier är det svårt att skilja en nysmittad patient från en som har haft infektionen en längre tid med utgångspunkt från treponemalt IgM. Detta förhållande med kvardröjande IgM behöver dock inte påverka värderingen av nyttan av IgM test vid detektion av tidig syfilisinfektion. Korrelation i denna studie mellan svag/stark eller negativ RPR reaktivitet och korresponderande IgM positivitet var inte helt överensstämmande och kunde därför inte styrkas. I gruppen med aktuell/nysmittad syfilisinfektion går det inte att uttala sig om IgM positivitet är korrelerat med RPR reaktivitet då hälften av proverna fick IgM positivitet medan den andra hälften inte fick det. Bland gruppen med utläkta patienter påvisades IgM negativitet i kombination RPR reaktivitet samt att IgM negativitet påvisades hos patienter med RPR negativitet. I gruppen med ospecifik screeningreaktivitet påvisades IgM negativitet i kombination med RPR negativitet. Om RPR är negativt blir också IgM negativt i samtliga grupper och om RPR är reaktivt kan IgM både vara positiv och negativ. På grund av IgM testets låga sensitivitet och avsaknad av kliniska data och att testerna inte är helt jämförbara försvåras bedömningen om korrelationen. 23

Syphilis Virclia IgM Monotest Vid sökning på PubMed återfinns i nuläget ingen utvärdering på Syphilis virclia IgM monotest i jämförele med andra IgM tester. Sammantaget uppvisade Syfilis Virclia IgM Monotest en klart lägre känslighet än Recomwell Treponema IgM. En faktor som eventuellt skulle kunna påverka sensitiviteten för Syfilis Virclia IgM Monotest är den nuvarande gränsen för ett positivt utfall (cut-off ). I testet var < 0.9 negativt, 0,9-- var gränsvärde och >, var positivt. För de ospecifika proverna från Örebro låg indexvärdet mellan range 0,026-0,375 som samtliga blev negativa i Syfilis Virclia IgM Monotest. Hos de prover från Göteborg och Guinea-Bissau som fick falskt negativt resultat hamnade samtliga inom ett något högre intervall av index som sträckte sig mellan range 0,24-0,68 (figur 6). Om gränsen för cut-off hypotetiskt skulle justeras till exempelvis 0,6 skulle ytterligare fem prover blivit positiva för Syfilis Virclia IgM Monotest. Detta skulle dock endast innebära en ökning av sensitiviteten från 54% till 73%, under förutsättning att Recomwell Treponema IgM utgör gold standard. Ett sådant resonemang innebär dock en risk för att försämrad specificitet erhållas. För att testa detta skulle det behöva analyseras ett större provmaterial med tillhörande kliniska data. En annan tänkbar faktor som skulle kunna påverka testets sensitivitet är att Syphilis Virclia IgM Monotest har två rekombinanta antigen Tpp7 och Tpp47 medan Recomwell Treponema IgM använder sig av fyra rekombinanta antigen TP5, TP7, TP47 respektive TmpA. Utöver Tpp7 och Tpp47 som överensstämmer hos de båda testen har även antikroppsreaktioner påvisats för antigenen TP5 och TmpA hos patienter med tidig syfilis (2). Det automatiserade Syphilis Virclia IgM Monotestet utfört i instrumentet VirCliachemiluminesence var lätt att handhava eftersom behovet av manuellt arbete var begränsat. Analysinstrumentets programvara hade ett logiskt mönster samt tydliga rubriker för att underlätta provregistrering, reagenstillsats samt initiering av en ny körning. Utförandet av den automatiserade analysen tog två timmar vilket möjliggör att personal i en klinisk verksamhet kan utföra andra arbetsuppgifter under väntetiden. Ett sådant automatiserat IgM test skulle därför vara tidsbesparande jämfört med ett manuellt IgM test. Recomwell Treponema IgM har motsvarande analystid men med manuellt arbete vid olika tidpunkter under analysen. Nackdelen med Syphilis Virclia IgM Monotest var testets låga analytiska sensitivitet vid jämförelse mot Recomwell Treponema IgM. 24

Ett IgM test skulle kunna tillföra mervärdet att i ett tidigt stadie kunna diagnostisera en syfilisinfektion, utesluta ny infektion hos patienter med utläkt syfilis samt bidra vid diagnostik av kongenital syfilisinfektion. Testet skulle också kunna bidra till en säkrare bedömning vid misstanke om ospecifik reaktivitet i screeningtest. Med den begränsade känslighet som Syphilis Vircila IgM Monotest uppvisade i denna utvärdering är dock dess nytta tveksam. En begränsning i denna studie var att det var ett litet provmaterial som analyserats, ju mindre provmaterial som analyseras desto större risk för slumpvariationer. En annan svaghet var att inte samtliga prover analyserades dubbelt med Recomwell Treponema IgM samt att prover från nyfödda vars mödrar haft en pågående syfilisinfektion inte fanns att tillgå som analysmaterial. För övrigt hade studien begränsad tillgång till klinisk information. Slutsats Syfilis Virclia IgM Monotest uppvisade i jämförelse med Recomwell Treponema IgM en sensitivitet på 54%, vilket gör att mervärdet av testet är tveksamt. För att kunna avgöra den framtida användningen för Syfilis Virclia IgM Monotest krävs ytterligare studier med fokus på kongenital infektion samt väldokumenterad klinisk data för patienter med tidig infektion. Tack till Jag vill tacka mina handledare, Kerstin Malm och Martin Sundqvist, från Universitetssjukhuset i Örebro som möjliggjort denna studie. Ett stort tack till Jenny Isaksson från Sahlgrenska Universitetssjukhuset för ett gott samarbete vid urval av patientprover samt analysutförande av kompletterande provmaterial som tillkom i studien. 25

Referenser. Brauner A, Arvidson S, Blomberg J, Castor B, Falk K, Kärre K et al. Medicinsk mikrobiologi och immunologi. 2 uppl. Lund: Studentlitteratur; 205. 2. Norris SJ. Polypeptides of Treponema pallidum: progress toward understanding their structural, functional, and immunologic roles. Microbiol Rev. 993 Jun;57(3):750-79. 3. Ho EL, Lukehart SA. Syphilis: using modern approaches to understand an old disease. J Clin Invest. 20 Dec;2(2):4584-92. 4. Seña AC, White BL, Sparling PF. Novel Treponema pallidum serologic tests: a paradigm shift in syphilis screening for the 2st century. Clin Infect Dis. 200 Sep 5 ;5(6):700-8. 5. Chapel TA. The signs and symptoms of secondary syphilis. Sex Transm Dis. 980 Oct-Dec;7(4):6-64. 6. Mindel A, Tovey SJ, Timmins DJ, Williams P. Primary and secondary syphilis, 20 years experience. 2. Clinical features. Genitourin med. 989 Jan;65(): 3. 7. Socialstyrelsens föreskrifter om blodverksamhet (SOSFS 2009:28) [Internet]. Stockholm: Socialstyrelsen [citerad 208 februari 4]. Hämtad från: http://www.socialstyrelsen.se/sosfs/2009-28 8. Harter C, Benirschke K. Fetal syphilis in the first trimester. Am J Obstet Gynecol. 976 Apr ;24(7):705-. 9. Walker GJ, Walker DG. Congenital syphilis: a continuing but neglected problem. Semin Fetal Neonatal Med. 2007 Jun;2(3):98-206. 0. Tille PM. Bailey and Scott s Diagnostic microbiology. 3 uppl. St. Louis: Elsevier; 204.. Kwak J, Lamprecht C. A review of the guidelines for the evaluation and treatment of congenital syphilis. Pediatr Ann. 205 Maj;44(5):08-4. 2. Socialstyrelsens föreskrifter om infektionsscreening av gravida (SOSFS 2004:3) [Internet]. Stockholm: Socialstyrelsen [citerad 208 februari 4]. Hämtad från: https://www.socialstyrelsen.se/lists/artikelkatalog/attachments/0257/2004-0- 3_2004_3.pdf 3. Gust DA, Levine WC, St Louis ME, Braxton J, Berman SM. Mortality associated with congenital syphilis in the united states, 992-998. Pediatrics. 2002 May;09(5): E79-9. 26