Fosfatidyletanol i helblod (B-PEth)

Fosfatidyletanol i helblod (B-PEth) Labmedicin Skåne, Klinisk kemi Lund therese.hansson@skane.se EQUALIS Användarmöte Läkemedel/Toxikologi, 4 november 2010

PEth grupp - Lund Anders Isaksson Lisa Walther Anders Andersson 2

Kliniska laboratorietester för bruk och missbruk av alkohol idag Påverkad av alkohol Nykter? Akut alkoholintag Etanol 5-HTOL, FAEE, EtG, EtS Riskabla alkoholvanor? CDT, PEth RISKBRUK Kroniskt missbruk Organskada? GGT, MCV, ASAT, ALAT MISSBRUK 3

Fosfatidyletanol i helblod (B-PEth) Vad är PEth? Varför är PEth bra som alkoholmarkör? Vilka metoder finns för PEth analys? Hur bedöms en PEth koncentration i förhållande till alkoholintag? Vem är intresserad av PEth analys? Finns det något externt kontrollprogram? 4

Vad är PEth? 5

Vad är PEth? o PEth är en fosfolipid som normalt inte förekommer i kroppen, men som bildas i närvaro av alkohol (etanol) med hjälp av enzymet fosfolipas D (PLD). FOSFATIDYLKOLIN (PC) O II R 1 - C - O - CH 2 I R 2 - C - O - CH O CH 3 II I II I O CH 2 O - P-O - CH 2 - CH 2 - N + - CH 3 I I O - CH 3 Fosfolipas D(PLD) Etanol FOSFATIDYLETANOL (PEth) O II R 1 - C - O - CH 2 I R 2 - C - O - CH O II I II O CH 2 O - P-O - CH 2 - CH 3 I O - o PEth ansamlas i röda blodkropparna vid alkoholmissbruk 6

Fosfolipas D Fosfolipider finns i cellmembraner Polär huvudgrupp Fosfatidylkolin H 2 O H 2 O CELLMEMBRANET etanol etanol etanol H 2 O Fettsyrasvansar 7

PLD PEth bildas endast i närvaro av etanol kolin Fosfatidylkolin H 2 O etanol Hydrolys kolin Fosfolipas D Transfosfatidylering kolin fosfatidsyra etanol PEth (fosfatidyletanol) 8

PEth olika former 9

Varför är PEth bra som alkoholmarkör? 10

Specificiteten är hög (teoretiskt 100%). Endast etanol ger upphov till mätbara nivåer av PEth. PEth är en direkt etanol metabolit. Sensitiviteten är hög. Har visat sig i studier vara högre än CDT, MCV och GGT såväl var för sig som i kombination. 11

Alkoholöverkonsumtion olika kliniska markörers sensitivitet Andel positiva utfall Test Gräns Sensitivitet (%) PEth (µmol/l) >0.22 99 CDT disialo% >1.7 77 GGT (µkat/l) a 44 MCV (fl) >98 40 a kvinnor >40 år <1,3 µkat/l män >40 år <2,0 µkat/l CDT + GGT 85 CDT + MCV 78 MCV + GGT 61 Ref: Aradottir S, Asanovska G, Gjerss S, Hansson P, Alling C, Alcohol & Alcoholism 2006; 41(4): 431-437. 12

PEth, total (µmol/l) HPLC PEth kontra CDT Patientprover analyserade i rutin (n=969) PEth CDT 10,0 1,5 8,6 1,5 6,4 1,3 16 14 12 22 % 10 8 21% 6 4 2 0 55 % 2 % 0 2 4 6 8 10 12 14 16 CDT (disialo%) HPLC Ref: Isaksson A, Walther L, Alling C, Hansson T. Läkartidningen 2009;15: 1094-1098 13

Fallbeskrivning o o o o o o o Man ansöker om nytt körkort CDT 2,4-2,8 % i upprepade prover Nekades nytt körkort Mannen förnekade alkoholkonsumtion GGT och MCV normala. PEth ej detekterbart i något av de upprepade proven Mannen beviljades nytt körkort. 14

Vilka metoder finns för PEth analys? 15

Metoder för PEth analys o HPLC (-ELSD) o Masspektrometri (LCMS, LCMSMS) o Kapillär elektrofores (CE) o Immunoassay o TLC 16

Provtagning / Provhantering o Provtagning: o Venös provtagning i EDTA-rör (lila propp). Provet skall inte centrifugeras och får inte frysas. o Provhantering: o PEth kan bildas in vitro i blodet om det innehåller etanol. o Bildningen är dock försumbar: o Upp till 24 h i rumstemp. o Upp till 3 veckor i kyl o Vid längre förvaring fryses blodet och förvaras i -70C. Provet ska inte frysas i -20C. o Utan etanol innehåll är PEth halten stabil i flera veckor även i rumstemp. 17

Provupparbetning (HPLC och LCMS(MS)) o Provupparbetning: 1. EDTA-Blod + internstandard 2. Lipidextraktion 2-propanol:hexan (2:3) 3. Mixas och centrifugeras 4. Lipidlösningen hälls över till nytt rör. Pelleten kastas. 5. Indunstas och återlöses i mobilfas anpassat lösningsmedel 6. Överförs till vial och injiceras på HPLC / LCMS(MS) 18

PEth - HPLC o HPLC-method med ljusspridningsdetektor var den första metoden i klinisk rutindrift (Lund 2006) o Mäter summan av alla PEth former (= PEth total) o Mätvärden kliniskt: > 0,70 µmol/l 19

mv mv 8,822 PEth HPLC kromatogram 200,00 180,00 160,00 140,00 120,00 100,00 80,00 60,00 40,00 20,00 0,00-20,00 8,35 8,40 8,45 8,50 8,55 8,60 8,65 8,70 8,75 8,80 8,85 8,90 8,95 9,00 9,05 9,10 9,15 9,20 9,25 Minutes 260,00 240,00 220,00 Internstandard PBut 200,00 180,00 160,00 PEth Kalibrator 140,00 120,00 100,00 80,00 PEth Patient 60,00 40,00 20,00 0,00 0,50 1,00 1,50 2,00 2,50 3,00 3,50 4,00 4,50 5,00 5,50 6,00 6,50 7,00 7,50 8,00 8,50 9,00 9,50 10,00 Minuter (min) 20

PEth- LCMS(MS) o Några år senare utvecklades LCMS och LCMSMS metoder för PEth analys (rutin 2010). Analyseras idag i klinisk rutin i Lund och Stockholm. o Mäter de enskilda formerna av PEth o Mätvärden kliniskt: >0,10 µmol/l 21

LCMSMS - PEth 16:0/18:1 Fragmentering *API4000 Results Name: N/A *Labmedicin Skåne Klinisk kemi Lund Project: Utv_PEth_Krister -MS2 (701.56) CE (-52): 26 MCA scans from Sample 1 (TuneSampleName) of PEth 16_0 18_1 Enzo_InitProduct_Neg.wiff (Turbo Spray) 255 281.2 3.8e5 O Max. 3.8e5 cps. 3.6e5 O C H 2 3.4e5 3.2e5 O C H o 3.0e5 2.8e5 2.6e5 PEth 16:0/ 18:1 O 281 H 2 C O P O O - CH 2 CH 3 701.6 I n t e n s i t y, c p s 2.4e5 2.2e5 2.0e5 1.8e5 1.6e5 255.2 701,5 1.4e5 1.2e5 1.0e5 8.0e4 6.0e4 4.0e4 2.0e4 0.0 79.2 124.8 181.2 153.2 418.8 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 m/z, Da ESI, Negative ion mode [M-H] - Printing Date: 20 October 2010 Page 1 of 1 437.6 22

LCMSMS LC-MS/MS Precursor (m/z) Fragment Ion (m/z) Corresponding fatty acid Ret.tid Q1 Q3 (min) PEth 16:0 /18:1 701,5 255,2 16:0 4,19 281,2 18:1 PEth 16:0 /18:2 699,4 255,2 16:0 4,05 279,2 18:2 PEth 16:0 /20:4 723,3 255,2 16:0 4,01 303,5 20:4 PEth 18:0 /18:1 729,6 281,2 18:1 4,41 283,2 18:0 PEth 18:0 /18:2 727,6 279,2 18:2 4,28 283,2 18:0 PEth 18:1 /18:1 727,6 281,2 18:1 4,23 Pprop 18:1 /18:1 741,3 281,2 18:1 4,23 ESI, Negative ion mode [M-H] - 23

LCMSMS Fosfatidyletanol *Sciex API4000 I n t e n s i t y, c p s XIC of -MRM (20 pairs): 701.5/255.3 Da ID: Peth 16:0 18:1_255 from Sample 5 (PEth kal 2) of LCMS8_101007_50A.wiff (Turbo Spray) 9.0e5 8.0e5 7.0e5 6.0e5 5.0e5 4.0e5 3.0e5 2.0e5 m/z 701.5 / 281.2 PEth 16:0/18:1 Ret.tid = 4,19 min 4.21 *University and Regional Laboratories Region Skåne m/z 701.5 / 255.2 Max. 3.8e5 cps. Internstandard Fosfatidylpropanol 1.0e5 5.35 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 Time, min XIC of -MRM (20 pairs): 741.3/281.2 Da ID: PProp_18:1 from Sample 5 (PEth kal 2) of LCMS8_101007_50A.wiff (Turbo Spray) Max. 1.8e6 cps. I n t e n s i t y, c p s 1.8e6 1.6e6 1.4e6 1.2e6 1.0e6 8.0e5 6.0e5 PProp 18:1/18:1 m/z 741.3 / 281.2 Ret.tid = 4,23 min 4.24 4.0e5 2.0e5 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 Time, min 5.21 24

PEth 16:0/18:1 i kalibrator och patient *Sciex API4000 *University and Regional Laboratories Region Skåne XIC of -MRM (20 pairs): 701.5/255.3 Da ID: Peth 16:0 18:1_255 from Sample 5 (PEth kal 2) of LCMS8_101007_50A.wiff (Turbo Spray) Max. 3.8e5 cps. 9.0e5 8.5e5 8.0e5 7.5e5 7.0e5 m/z 701.5/281.2 Kalibrator PEth 16:0/18:1 2,0 µmol/l I n t e n s i t y, c p s 6.5e5 6.0e5 5.5e5 5.0e5 4.5e5 4.0e5 4.21 3.5e5 3.0e5 2.5e5 2.0e5 m/z 701.5/255.2 1.5e5 1.0e5 5.0e4 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 Time, min *Sciex API4000 *University and Regional Laboratories Region Skåne XIC of -MRM (20 pairs): 701.5/255.3 Da ID: Peth 16:0 18:1_255 from Sample 27 (470529-3704) of LCMS8_101007_50A.wiff (Turbo Spray) Max. 6.7e5 cps. 1.5e6 Patient PEth 16:0/18:1 3,5 µmol/l I n t e n s i t y, c p s 1.4e6 1.3e6 1.2e6 1.1e6 1.0e6 9.0e5 8.0e5 7.0e5 4.19 m/z 701.5/281.2 6.0e5 5.0e5 4.0e5 m/z 701.5/255.2 3.0e5 2.0e5 1.0e5 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 Time, min 25

Korrelation mellan HPLC och LCMSMS B-PEth 16:0/18:1_281, LCMSMS (µmol/l) - Den dominerande PEth formen PEth 16:0/18:1 14 12 PEth 16:0 18:1 ~45% 10 8 6 4 2 R 2 = 0,9697 0 0 2 4 6 8 10 12 14 B-PEth total, HPLC (µmol/l) 26

LCMSMS- PEth 0,04 µmol/l Project: Utv Peth Klinisk kemi och farmakologi USiL Results Name: N/A XIC of -MRM (24 pairs): 701.6/281.3 Da ID: Peth 16:0 18:1_281 from Sample 13 (Boel 100225) of Kalibreringsserier1_2_100226.wi... Max. 3.6e5 cps. PEth 16:0 18:1_281 7.0e4 6.5e4 Ret.tid = 4,27 min 6.0e4 5.5e4 5.0e4 I n t e n s i t y, c p s 4.5e4 4.0e4 3.5e4 3.0e4 B-PEth = 0,04 µmol/l 2.5e4 2.0e4 1.5e4 1.0e4 B-PEth not detected 5000.0 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 8.5 Time, min Printing Date: Friday, April 09, 2010 Page 1 of 1 27

Hur bedöms en PEth koncentration i förhållande till alkoholintag? 28

PEth, total (µmol/l) Det finns ett samband mellan redovisad alkoholkonsumtion de senaste två veckorna och mätvärdet. 18 16 14 12 HPLC Ju kraftigare alkoholkonsumtion desto högre mätvärde 10 8 6 Lång detekterbarhet efter att man har slutat dricka. Halveringstiden är ca 4 dygn. Positiva fynd görs upp till 2-4 veckor efter avslutat alkoholintag. 4 2 0 0-5 0 50-100 100-150 Etanol intag 150-200 200-250 (g/dag) >250 Ref: Aradottir S, Asanovska G, Gjerss S, Hansson P, Alling C. Alcohol Alcohol 2006, 41 (4): 431-437 29

Bedömning (baserad på HPLC) PEth, total (µmol/l) Medelkonsumtion under 2 veckor (gram etanol /dygn) 1 burk starköl 20 g etanol < 0,7 Ingen eller måttlig 2,0 50 3,5 50-100 5,5 100-150 7,0 150-250 > 7,0 >250 75 cl sprit (40%) 240 g etanol 1 glas vin (15 cl, 12%) 14 g etanol 1 flaska vin 70 g etanol 30

Bedömning - LCMSMS PEth (µmol/l) Alkohol konsumtion < 0,10 Ingen eller väldigt låg 0,10 0,70 Måttlig > 0,70 > Måttlig 31

PEth-nivåer hos våra patienter o PEth rutinprover analyserade med HPLC maj-sept. 2006 (n=623) o PEth rutinprover analyserade med LCMSMS april-juni 2010 (n=3154) PEth (µmol/l) > 5,5 (2,6%) PEth (µmol/l) PEth (µmol/l) >5,5(2%) 0,7-2,0 (19%) 2,0-5,5 (12%) < 0,7 (67%) 2,0-5,5 (13%) 0,7-2,0 (19%) <0,1 (37%) 0,1-0,7 (29%) <0,7 (66%) 32

Vem är intresserad av PEth analys? 33

Antal patientprover Produktionsstatistik Klinisk kemi, Lund Produktionsstatistik per år 12000 10000 2010: tom sept. 8000 6000 4000 2000 0 2006 2007 2008 2009 2010 CDT 9176 9381 9557 9732 6686 PEth 1305 4701 7560 9839 8290 34

Beställare 2009 Antal olika Antal analyser beställare per grupp AC Akutmottagn 10 43 AL Alkoholklnik 8 584 BA Barnmed klinik 2 2 BH Brahehälsan 1 28 BP Barn o Ungdomspsyk 1 274 CI Citykliniken 7 40 EN Endokrinologi 5 24 FH Företagshälsovård 94 1976 GE Geriatrisk klinik 2 12 GS Gastroenterologisk klinik 6 65 GU Gullberga psyk klinik 1 11 HC Hälsovårdscentral (landsting) 5 40 HD Hjärt-Lung division 7 56 HE Husläkare 1 1 HU Hudklinik 2 6 IN Infektionsklinik 10 134 IV Intensivvårdsavdelning 4 6 KA Kardiolog klinik 3 5 KE Klinisk kemi lab 4 313 KI Kirurgisk klinik 23 103 KL Karolinska Stockholm 2 5 KR Kriminalvård 1 2 KT Kognitiv medicin 2 10 LG Läkargruppen 12 30 LS Läkarstation 5 69 Antal olika Antal analyser beställare per grupp LU Lungklinik 4 4 ME Medicinsk klinik 125 887 NK Neurokirurgisk klinik 1 1 NL Neurologisk klinik 6 21 NV Nova kliniken 4 34 PP Privarpraktiserande läkare 54 372 PS Psyk klinik 62 821 RE Reumatologisk klinik 3 7 RH Rehab klin 2 5 RM Rättsmedicin 1 61 SL Spec mottagning 4 54 SN Statens Institutionsstyrelse (SIS) 1 7 SV Socialvården 3 19 TN Transplantationsmottagning 5 94 UR Urologisk klinik 1 1 VC Vårdcentral 106 2938 VL Vårdcentral (extern inom MLL) 4 43 YM Yrkesmedicinsk klinik 1 8 ZF Militär sjukvårdsinrättning 1 8 ÖS Östra sjukhuset 2 15 ÖÖ Övriga, ej kodade (industri, företag etc)11 81 619 9320 35

Finns det något externt kontrollprogram för PEth? 36

EQUALIS B-PEth (Fosfatidyletanol i blod) 2 Testutskick under 2010 Analysomgång: 2010-20 (våren) 2010-38 (hösten) o 2010-20: 3 laboratorier (3 Sverige) 2010-38: 5 laboratorier (4 Sverige + 1 Tyskland) o 3 prover per utskick o Materialbeskrivning: Poolat helblod med tillsats av K2-EDTA o Provet ska analyseras senast 7 dagar från utskickat datum. o Total PEth och/eller PEth 16:0/18:1 o Ange metoden (HPLC / LCMS / LCMSMS). o Ev. program med start 2011. 37

EQUALIS Fosfatidyletanol i blod (B-PEth) Analysomgång: 2010-20 3 deltagare METOD KOMPONENT 2010-20/A 2010-20/B 2010-20/C LC-MS PEth-16:0/18:1 <0,1 2,86 0,38 LC-MS PEth-16:0/18:1 0 3,31 0,46 LC-MS/MS PEth-16:0/18:1 <0,05 2,83 0,39 LC-MS PEth, total <0,1 6,41 0,93 LC-MS PEth, total 0 6,96 1,14 LC-MS/MS PEth, total <0,1 6,00 0,84 HPLC-ELSD PEth, total <0,70 5,30 0,87 38

EQUALIS Fosfatidyletanol i blod (B-PEth) Analysomgång: 2010-38 5 deltagare Lab kod METOD KOMPONENT 2010-38/A 2010-38/B 2010-38/C 1114-1 LC-MS B-PEth, 16:0/18:1 1,4 0 0,42 3340-1 LC-MS B-PEth, 16:0/18:1 1,7 0 0,5 253-1 LC-MS-MS B-PEth, 16:0/18:1 0,56 0 0,18 3886-1 LC-MS-MS B-PEth, 16:0/18:1 1,2 0,04 0,43 503-1 LC-MS-MS B-PEth, 16:0/18:1 0,99 <0,05 0,30 1114-1 LC-MS B-PEth, total 3 0 1 3340-1 LC-MS B-PEth, total 3,88 0 1,43 253-1 B-PEth, total 3886-1 LC-MS-MS B-PEth, total 1,4 0,11 0,54 503-1 LC-MS-MS B-PEth, total 2,1 <0,1 0,63 503-1 HPLC-ELSD B-PEth, total 2,4 0 0,91 39

Koncentration ( µmol/l) EQUALIS Fosfatidyletanol i blod (B-PEth) 2010-38 Analysomgång: PEth 2010-38/A-C 4,0 3,5 PEth, total PEth, 16:0/18:1 3,0 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 0,0 A-PEth,total B-PEth,total C-PEth,total A-PEth 16:0/18:1 B-PEth 16:0/18:1 C-PEth 16:0/18:1 40

Koncentration ( µmol/l) EQUALIS - B-Fosfatidyletanol (B-PEth) 2010-38 4,0 3,5 PEth, total A C 1,8 1,6 PEth 16:0 18:1 A C 3,0 1,4 2,5 2,0 1,5 1,2 1,0 0,8 0,6 1,0 0,4 0,5 0,2 0,0 A-HPLC A-LCMS A-LCMSMS C-HPLC C-LCMS C-LCMSMS 0,0 A-LCMS A-LCMSMS C-LCMS C-LCMSMS PEth, total för de positiva proven A och C med olika metoder. Strecket visar medelvärdet. PEth 16:0/18:1 för de positiva proven A och C med olika metoder. Strecket visar medelvärdet. 41

TACK! 42