Vitamin D Lc-Ms/Ms. Benny Larsson Laboratorie Medicin Skåne Klinisk Kemi Malmö

Storlek: px

Starta visningen från sidan:

Download "Vitamin D Lc-Ms/Ms. Benny Larsson Laboratorie Medicin Skåne Klinisk Kemi Malmö"

Sten Isaksson
för 8 år sedan
Visningar:

1 Vitamin D Lc-Ms/Ms Benny Larsson Laboratorie Medicin Skåne Klinisk Kemi Malmö

2 25-OH-Vitamin D3 + D2 3-epi-25-OH-Vitamin D3 + D2 1,25-di-hydroxy-Vitamin D3+D2

3 25-OH-Vitamin D3 + D2 3-epi-25-OH-Vitamin D3 + D2 1,25-di-hydroxy-Vitamin D3+D2

4 Vilken metabolit skall analyseras? Även genom kost och Supplement D3 + D2 UV-B Sol 7-dehydrocholesterol Pre-Vitamin D Hud D3 Lever + 3-epi form Förrådsformen nmol/l 25(OH)D3 + D2 Aktiva formen pmol/l Njure 1,25(OH)2D3+D2 Målorgan

6 Shimadzu Prominence Applied API 4000 Q0 Q1 Q2 Q3 1.Spänning (V) Detektor 2.Frekvens (Hz) 3.Polaritet (±) Jonkälla ESI/APCI

7 UV/VIS detektor Avgasning Kolonnugn + kolonnväxlare Pumpar Rackväxlare Autoinjektor

8 Triple Quadrupole Sequence of Events Ion production Ion transport Ion filtering Fragmentation Ion filtering Ion detection

9 1. Step Ion production

10 Atmospheric Pressure Chemical Ionization Vitamin D Heated Nebulizer source: Atmospheric Pressure Chemical Ionization (APCI) polar to unpolar and thermally stable compounds

11 Provupparbetning 1.Proteinfällning 2.Indunstning 3.Återlösning

12 Proteinfällning Fällningsplatta 100µL Serum 400µL Acetonitril/ internstandard Uppsamlingsplatta

13 Vacum elut Efter 60 min 4 C Proteinfällningsplatta Uppsamlingsplatta

14 Indunstning SPE Dry 96 Återlösning mobilfas Varm kvävgas 50 C

15 Deutererad Internstandard 25-OH-Vitamin D3 25-OH-Vitamin D3-d6 D= Väte(2H) med både proton och neutron i kärnan (masstal 2)

16 Vit D3-kvalificeringsjon Vit D3-huvudjon Internstandard-D3d6 Vit D2 383,3 / 91,1 383,3 / 211,2 389,4 / 91,1 395,5 / 91,3

17 Internkontroll integrering D2 D3 huvudjon D3 kvalific-jon IST IST IST

18 Patientprov med D2 D2=9nmol/L IST D3= 32nmol/L IST D3 kvalific-jon IST

19 Vit D3+D2 el bara D3? D2 form vanligt förekommande som supplement i Sverige Endast D2 form godkänt som supplement i USA (FDA) D2 formens effektivitet omtvistad, enligt vissa studier lika effektiv J Clin Endocrinol Metab March; 93(3): Michael F.Holick mfl Toxiciteten av D2 inte klargjord

godkänt som supplement i USA (FDA) D2 formens effektivitet omtvistad,

20 Ex.Patientprover Malmö D3 + D2 Patienter D3 - D2 Patienter D3 - D D2 = 540 D3 =17 nmol/l nmol/l Vit D2 D2 Vit Vit D3 D3 Vit

nmol/l 200 500 400 150 Vit D2 D2 Vit Vit D3 D3 Vit

21 25-OH-Vitamin D3 + D2 3-epi-25-OH-Vitamin D3 + D2 1,25-di-hydroxy-Vitamin D3+D2

22 3-epi former av 25-OH-Vitamin D3 + D2 Exakt samma moderjoner och fragment, dvs masspektrometer kan inte skilja dessa åt

23 3-epi-25-OH-Vit D2+D3 Lever 3-epi-1,25-(OH)2 -Vit D2+D3 Njurar

24 Effekter hos barn <1 år Kan ha 10-60% som epi former, orsak ej klargjord, omogenhet??? Omognad i första hydroxyleringssteget i lever Binder till Vitamin D binding protein för transport Sänker parathormon(pth) lika effektivt Calcium transporten till skelett signifikant lägre med epi-formen Binder signifikant sämre till vitamin-d receptorn i målorganen???

25 Referens artikel, Pub Med 1α, 25 (OH) 2-3-Epi-Vitamin D3, a Natural Physiological Metabolite... F Molnár (2011) 1α,25(OH)2-3-Epi-Vitamin D3, a Natural Physiological Metabolite of Vitamin D3: Its Synthesis, Biological Activity and Crystal Structure with Its Receptor.... Visar på biologisk effekt hos målorgan

26 Metod för epi-form barn 1år Måste separeras kromatografiskt Samma provupparbetning Samma elueringslösningar, ny gradient Ny analyskolonn: Ascentis Express, 10cm 3,0mm Id 2.7µm partiklar Analystid: 12 min Analyseras på barn <1år

27 NIST Referensmetod Vitamin D (epi-former) 40 min

28 Ny metod 3-epi-Vitamin D NIST med 3-epi Vit D3 D3 3-epi-D3 6,8 min IST

29 NIST referensstandard med 3-epi-25-OH-Vitamin D3 Börvärde NIST: D3= 82,3 D2= 5,81 Malmö värde epi-metod: D3= 81,7 D2= 5,88 25-OH-D3 25-OH-D2 3-epi-form IST IST

30 Vuxen normalnivå epi-form D3 med epi-form medräknad= 49.8 utan epi= 49.2 Diff 0.6 = 1% 3-epi Vit D3

31 Vuxen 72 år högst epi-konc av 90 vuxenprover D3 med epi-form medräknad= 62,7 utan epi= 59 Diff 3,7 = 6%

32 Samma prov och upparbetning, analyserat med Epi-metod D3 = 68 nmol/l, D2 = 94 nmol/l Barn 2 mån Rutin D3 = 133 nmol/l, D2= 132 nmol/l Diff D3 Epi D3 = 65 nmol/l ( 49%) Diff D2 Epi D2 = 38 nmol/l ( 29%) Epi-D2 Epi-D3 IST IST

33 Barn 9 mån D3 med epi-form medräknad= 76 utan epi= 71 Diff 5 = 7%

34 Barn 4 mån D3 med epi-form medräknad= 41 utan epi= 34 Diff 7 = 17%

35 25-OH-Vitamin D3 + D2 3-epi-25-OH-Vitamin D3 + D2 1,25-di-hydroxy-Vitamin D3+D2

36 DHVD 2D kromatografi Prov renas Separation dubbla kolonner Prov 100µL injiceras Li-aduct + 7 Da Renat Prov Gradient pumpar A= 0.5mM LiAcetat i H2O B= 0.5mM LiAcetat i MeOH Tvättpumpar A= H2O B= 25% ACN i MeOH LiAcetate

37 Rackväxlare Autoinjektor Sciex 5500 QTrap ESI jonisering Liaduct Renat prov Tvättpumpar 2 st Gradientpumpar 2 st Li Kolonnugn 6 pos Valco-valve 10-ports System-controller HPLC

38 DHVD kalibreringskurva DHVD3 IST-d6

39 Pat-prov DHVD 60 picomol/l 1,25-di-hydroxy-Vit D3 60 picomol/l Ref.omr picomol/l

40 Tack för visat intresse Frågor?

Relevanta dokument

Endokrinmöte Stockholm

Endokrinmöte Stockholm 2017-09-22 Steroider Lc-Ms/Ms vs Immunkemi? Benny Larsson Kallners diskussionsforum Det är bra att nyttan av ackrediteringen diskuteras. Jag har länge irriterat mig över att inadekvata