Fosfatidyletanol i helblod (B-PEth)

Transkript

1 Fosfatidyletanol i helblod (B-PEth) Labmedicin Skåne, Klinisk kemi Lund therese.hansson@skane.se EQUALIS Användarmöte Läkemedel/Toxikologi, 4 november 2010

2 PEth grupp - Lund Anders Isaksson Lisa Walther Anders Andersson 2

3 Kliniska laboratorietester för bruk och missbruk av alkohol idag Påverkad av alkohol Nykter? Akut alkoholintag Etanol 5-HTOL, FAEE, EtG, EtS Riskabla alkoholvanor? CDT, PEth RISKBRUK Kroniskt missbruk Organskada? GGT, MCV, ASAT, ALAT MISSBRUK 3

4 Fosfatidyletanol i helblod (B-PEth) Vad är PEth? Varför är PEth bra som alkoholmarkör? Vilka metoder finns för PEth analys? Hur bedöms en PEth koncentration i förhållande till alkoholintag? Vem är intresserad av PEth analys? Finns det något externt kontrollprogram? 4

5 Vad är PEth? 5

6 Vad är PEth? o PEth är en fosfolipid som normalt inte förekommer i kroppen, men som bildas i närvaro av alkohol (etanol) med hjälp av enzymet fosfolipas D (PLD). FOSFATIDYLKOLIN (PC) O II R 1 - C - O - CH 2 I R 2 - C - O - CH O CH 3 II I II I O CH 2 O - P-O - CH 2 - CH 2 - N + - CH 3 I I O - CH 3 Fosfolipas D(PLD) Etanol FOSFATIDYLETANOL (PEth) O II R 1 - C - O - CH 2 I R 2 - C - O - CH O II I II O CH 2 O - P-O - CH 2 - CH 3 I O - o PEth ansamlas i röda blodkropparna vid alkoholmissbruk 6

7 Fosfolipas D Fosfolipider finns i cellmembraner Polär huvudgrupp Fosfatidylkolin H 2 O H 2 O CELLMEMBRANET etanol etanol etanol H 2 O Fettsyrasvansar 7

8 PLD PEth bildas endast i närvaro av etanol kolin Fosfatidylkolin H 2 O etanol Hydrolys kolin Fosfolipas D Transfosfatidylering kolin fosfatidsyra etanol PEth (fosfatidyletanol) 8

9 PEth olika former 9

10 Varför är PEth bra som alkoholmarkör? 10

11 Specificiteten är hög (teoretiskt 100%). Endast etanol ger upphov till mätbara nivåer av PEth. PEth är en direkt etanol metabolit. Sensitiviteten är hög. Har visat sig i studier vara högre än CDT, MCV och GGT såväl var för sig som i kombination. 11

12 Alkoholöverkonsumtion olika kliniska markörers sensitivitet Andel positiva utfall Test Gräns Sensitivitet (%) PEth (µmol/l) > CDT disialo% > GGT (µkat/l) a 44 MCV (fl) >98 40 a kvinnor >40 år <1,3 µkat/l män >40 år <2,0 µkat/l CDT + GGT 85 CDT + MCV 78 MCV + GGT 61 Ref: Aradottir S, Asanovska G, Gjerss S, Hansson P, Alling C, Alcohol & Alcoholism 2006; 41(4):

13 PEth, total (µmol/l) HPLC PEth kontra CDT Patientprover analyserade i rutin (n=969) PEth CDT 10,0 1,5 8,6 1,5 6,4 1, % % % 2 % CDT (disialo%) HPLC Ref: Isaksson A, Walther L, Alling C, Hansson T. Läkartidningen 2009;15:

14 Fallbeskrivning o o o o o o o Man ansöker om nytt körkort CDT 2,4-2,8 % i upprepade prover Nekades nytt körkort Mannen förnekade alkoholkonsumtion GGT och MCV normala. PEth ej detekterbart i något av de upprepade proven Mannen beviljades nytt körkort. 14

15 Vilka metoder finns för PEth analys? 15

16 Metoder för PEth analys o HPLC (-ELSD) o Masspektrometri (LCMS, LCMSMS) o Kapillär elektrofores (CE) o Immunoassay o TLC 16

17 Provtagning / Provhantering o Provtagning: o Venös provtagning i EDTA-rör (lila propp). Provet skall inte centrifugeras och får inte frysas. o Provhantering: o PEth kan bildas in vitro i blodet om det innehåller etanol. o Bildningen är dock försumbar: o Upp till 24 h i rumstemp. o Upp till 3 veckor i kyl o Vid längre förvaring fryses blodet och förvaras i -70C. Provet ska inte frysas i -20C. o Utan etanol innehåll är PEth halten stabil i flera veckor även i rumstemp. 17

18 Provupparbetning (HPLC och LCMS(MS)) o Provupparbetning: 1. EDTA-Blod + internstandard 2. Lipidextraktion 2-propanol:hexan (2:3) 3. Mixas och centrifugeras 4. Lipidlösningen hälls över till nytt rör. Pelleten kastas. 5. Indunstas och återlöses i mobilfas anpassat lösningsmedel 6. Överförs till vial och injiceras på HPLC / LCMS(MS) 18

19 PEth - HPLC o HPLC-method med ljusspridningsdetektor var den första metoden i klinisk rutindrift (Lund 2006) o Mäter summan av alla PEth former (= PEth total) o Mätvärden kliniskt: > 0,70 µmol/l 19

20 mv mv 8,822 PEth HPLC kromatogram 200,00 180,00 160,00 140,00 120,00 100,00 80,00 60,00 40,00 20,00 0,00-20,00 8,35 8,40 8,45 8,50 8,55 8,60 8,65 8,70 8,75 8,80 8,85 8,90 8,95 9,00 9,05 9,10 9,15 9,20 9,25 Minutes 260,00 240,00 220,00 Internstandard PBut 200,00 180,00 160,00 PEth Kalibrator 140,00 120,00 100,00 80,00 PEth Patient 60,00 40,00 20,00 0,00 0,50 1,00 1,50 2,00 2,50 3,00 3,50 4,00 4,50 5,00 5,50 6,00 6,50 7,00 7,50 8,00 8,50 9,00 9,50 10,00 Minuter (min) 20

21 PEth- LCMS(MS) o Några år senare utvecklades LCMS och LCMSMS metoder för PEth analys (rutin 2010). Analyseras idag i klinisk rutin i Lund och Stockholm. o Mäter de enskilda formerna av PEth o Mätvärden kliniskt: >0,10 µmol/l 21

22 LCMSMS - PEth 16:0/18:1 Fragmentering *API4000 Results Name: N/A *Labmedicin Skåne Klinisk kemi Lund Project: Utv_PEth_Krister -MS2 (701.56) CE (-52): 26 MCA scans from Sample 1 (TuneSampleName) of PEth 16_0 18_1 Enzo_InitProduct_Neg.wiff (Turbo Spray) e5 O Max. 3.8e5 cps. 3.6e5 O C H 2 3.4e5 3.2e5 O C H o 3.0e5 2.8e5 2.6e5 PEth 16:0/ 18:1 O 281 H 2 C O P O O - CH 2 CH I n t e n s i t y, c p s 2.4e5 2.2e5 2.0e5 1.8e5 1.6e ,5 1.4e5 1.2e5 1.0e5 8.0e4 6.0e4 4.0e4 2.0e m/z, Da ESI, Negative ion mode [M-H] - Printing Date: 20 October 2010 Page 1 of

23 LCMSMS LC-MS/MS Precursor (m/z) Fragment Ion (m/z) Corresponding fatty acid Ret.tid Q1 Q3 (min) PEth 16:0 /18:1 701,5 255,2 16:0 4,19 281,2 18:1 PEth 16:0 /18:2 699,4 255,2 16:0 4,05 279,2 18:2 PEth 16:0 /20:4 723,3 255,2 16:0 4,01 303,5 20:4 PEth 18:0 /18:1 729,6 281,2 18:1 4,41 283,2 18:0 PEth 18:0 /18:2 727,6 279,2 18:2 4,28 283,2 18:0 PEth 18:1 /18:1 727,6 281,2 18:1 4,23 Pprop 18:1 /18:1 741,3 281,2 18:1 4,23 ESI, Negative ion mode [M-H] - 23

24 LCMSMS Fosfatidyletanol *Sciex API4000 I n t e n s i t y, c p s XIC of -MRM (20 pairs): 701.5/255.3 Da ID: Peth 16:0 18:1_255 from Sample 5 (PEth kal 2) of LCMS8_101007_50A.wiff (Turbo Spray) 9.0e5 8.0e5 7.0e5 6.0e5 5.0e5 4.0e5 3.0e5 2.0e5 m/z / PEth 16:0/18:1 Ret.tid = 4,19 min 4.21 *University and Regional Laboratories Region Skåne m/z / Max. 3.8e5 cps. Internstandard Fosfatidylpropanol 1.0e Time, min XIC of -MRM (20 pairs): 741.3/281.2 Da ID: PProp_18:1 from Sample 5 (PEth kal 2) of LCMS8_101007_50A.wiff (Turbo Spray) Max. 1.8e6 cps. I n t e n s i t y, c p s 1.8e6 1.6e6 1.4e6 1.2e6 1.0e6 8.0e5 6.0e5 PProp 18:1/18:1 m/z / Ret.tid = 4,23 min e5 2.0e Time, min

25 PEth 16:0/18:1 i kalibrator och patient *Sciex API4000 *University and Regional Laboratories Region Skåne XIC of -MRM (20 pairs): 701.5/255.3 Da ID: Peth 16:0 18:1_255 from Sample 5 (PEth kal 2) of LCMS8_101007_50A.wiff (Turbo Spray) Max. 3.8e5 cps. 9.0e5 8.5e5 8.0e5 7.5e5 7.0e5 m/z 701.5/281.2 Kalibrator PEth 16:0/18:1 2,0 µmol/l I n t e n s i t y, c p s 6.5e5 6.0e5 5.5e5 5.0e5 4.5e5 4.0e e5 3.0e5 2.5e5 2.0e5 m/z 701.5/ e5 1.0e5 5.0e Time, min *Sciex API4000 *University and Regional Laboratories Region Skåne XIC of -MRM (20 pairs): 701.5/255.3 Da ID: Peth 16:0 18:1_255 from Sample 27 ( ) of LCMS8_101007_50A.wiff (Turbo Spray) Max. 6.7e5 cps. 1.5e6 Patient PEth 16:0/18:1 3,5 µmol/l I n t e n s i t y, c p s 1.4e6 1.3e6 1.2e6 1.1e6 1.0e6 9.0e5 8.0e5 7.0e m/z 701.5/ e5 5.0e5 4.0e5 m/z 701.5/ e5 2.0e5 1.0e Time, min 25

26 Korrelation mellan HPLC och LCMSMS B-PEth 16:0/18:1_281, LCMSMS (µmol/l) - Den dominerande PEth formen PEth 16:0/18: PEth 16:0 18:1 ~45% R 2 = 0, B-PEth total, HPLC (µmol/l) 26

27 LCMSMS- PEth 0,04 µmol/l Project: Utv Peth Klinisk kemi och farmakologi USiL Results Name: N/A XIC of -MRM (24 pairs): 701.6/281.3 Da ID: Peth 16:0 18:1_281 from Sample 13 (Boel ) of Kalibreringsserier1_2_ wi... Max. 3.6e5 cps. PEth 16:0 18:1_ e4 6.5e4 Ret.tid = 4,27 min 6.0e4 5.5e4 5.0e4 I n t e n s i t y, c p s 4.5e4 4.0e4 3.5e4 3.0e4 B-PEth = 0,04 µmol/l 2.5e4 2.0e4 1.5e4 1.0e4 B-PEth not detected Time, min Printing Date: Friday, April 09, 2010 Page 1 of 1 27

28 Hur bedöms en PEth koncentration i förhållande till alkoholintag? 28

29 PEth, total (µmol/l) Det finns ett samband mellan redovisad alkoholkonsumtion de senaste två veckorna och mätvärdet HPLC Ju kraftigare alkoholkonsumtion desto högre mätvärde Lång detekterbarhet efter att man har slutat dricka. Halveringstiden är ca 4 dygn. Positiva fynd görs upp till 2-4 veckor efter avslutat alkoholintag Etanol intag (g/dag) >250 Ref: Aradottir S, Asanovska G, Gjerss S, Hansson P, Alling C. Alcohol Alcohol 2006, 41 (4):

30 Bedömning (baserad på HPLC) PEth, total (µmol/l) Medelkonsumtion under 2 veckor (gram etanol /dygn) 1 burk starköl 20 g etanol < 0,7 Ingen eller måttlig 2,0 50 3, , , > 7,0 > cl sprit (40%) 240 g etanol 1 glas vin (15 cl, 12%) 14 g etanol 1 flaska vin 70 g etanol 30

31 Bedömning - LCMSMS PEth (µmol/l) Alkohol konsumtion < 0,10 Ingen eller väldigt låg 0,10 0,70 Måttlig > 0,70 > Måttlig 31

32 PEth-nivåer hos våra patienter o PEth rutinprover analyserade med HPLC maj-sept (n=623) o PEth rutinprover analyserade med LCMSMS april-juni 2010 (n=3154) PEth (µmol/l) > 5,5 (2,6%) PEth (µmol/l) PEth (µmol/l) >5,5(2%) 0,7-2,0 (19%) 2,0-5,5 (12%) < 0,7 (67%) 2,0-5,5 (13%) 0,7-2,0 (19%) <0,1 (37%) 0,1-0,7 (29%) <0,7 (66%) 32

33 Vem är intresserad av PEth analys? 33

34 Antal patientprover Produktionsstatistik Klinisk kemi, Lund Produktionsstatistik per år : tom sept CDT PEth

35 Beställare 2009 Antal olika Antal analyser beställare per grupp AC Akutmottagn AL Alkoholklnik BA Barnmed klinik 2 2 BH Brahehälsan 1 28 BP Barn o Ungdomspsyk CI Citykliniken 7 40 EN Endokrinologi 5 24 FH Företagshälsovård GE Geriatrisk klinik 2 12 GS Gastroenterologisk klinik 6 65 GU Gullberga psyk klinik 1 11 HC Hälsovårdscentral (landsting) 5 40 HD Hjärt-Lung division 7 56 HE Husläkare 1 1 HU Hudklinik 2 6 IN Infektionsklinik IV Intensivvårdsavdelning 4 6 KA Kardiolog klinik 3 5 KE Klinisk kemi lab KI Kirurgisk klinik KL Karolinska Stockholm 2 5 KR Kriminalvård 1 2 KT Kognitiv medicin 2 10 LG Läkargruppen LS Läkarstation 5 69 Antal olika Antal analyser beställare per grupp LU Lungklinik 4 4 ME Medicinsk klinik NK Neurokirurgisk klinik 1 1 NL Neurologisk klinik 6 21 NV Nova kliniken 4 34 PP Privarpraktiserande läkare PS Psyk klinik RE Reumatologisk klinik 3 7 RH Rehab klin 2 5 RM Rättsmedicin 1 61 SL Spec mottagning 4 54 SN Statens Institutionsstyrelse (SIS) 1 7 SV Socialvården 3 19 TN Transplantationsmottagning 5 94 UR Urologisk klinik 1 1 VC Vårdcentral VL Vårdcentral (extern inom MLL) 4 43 YM Yrkesmedicinsk klinik 1 8 ZF Militär sjukvårdsinrättning 1 8 ÖS Östra sjukhuset 2 15 ÖÖ Övriga, ej kodade (industri, företag etc)

36 Finns det något externt kontrollprogram för PEth? 36

37 EQUALIS B-PEth (Fosfatidyletanol i blod) 2 Testutskick under 2010 Analysomgång: (våren) (hösten) o : 3 laboratorier (3 Sverige) : 5 laboratorier (4 Sverige + 1 Tyskland) o 3 prover per utskick o Materialbeskrivning: Poolat helblod med tillsats av K2-EDTA o Provet ska analyseras senast 7 dagar från utskickat datum. o Total PEth och/eller PEth 16:0/18:1 o Ange metoden (HPLC / LCMS / LCMSMS). o Ev. program med start

38 EQUALIS Fosfatidyletanol i blod (B-PEth) Analysomgång: deltagare METOD KOMPONENT /A /B /C LC-MS PEth-16:0/18:1 <0,1 2,86 0,38 LC-MS PEth-16:0/18:1 0 3,31 0,46 LC-MS/MS PEth-16:0/18:1 <0,05 2,83 0,39 LC-MS PEth, total <0,1 6,41 0,93 LC-MS PEth, total 0 6,96 1,14 LC-MS/MS PEth, total <0,1 6,00 0,84 HPLC-ELSD PEth, total <0,70 5,30 0,87 38

39 EQUALIS Fosfatidyletanol i blod (B-PEth) Analysomgång: deltagare Lab kod METOD KOMPONENT /A /B /C LC-MS B-PEth, 16:0/18:1 1,4 0 0, LC-MS B-PEth, 16:0/18:1 1,7 0 0, LC-MS-MS B-PEth, 16:0/18:1 0,56 0 0, LC-MS-MS B-PEth, 16:0/18:1 1,2 0,04 0, LC-MS-MS B-PEth, 16:0/18:1 0,99 <0,05 0, LC-MS B-PEth, total LC-MS B-PEth, total 3,88 0 1, B-PEth, total LC-MS-MS B-PEth, total 1,4 0,11 0, LC-MS-MS B-PEth, total 2,1 <0,1 0, HPLC-ELSD B-PEth, total 2,4 0 0,91 39

40 Koncentration ( µmol/l) EQUALIS Fosfatidyletanol i blod (B-PEth) Analysomgång: PEth /A-C 4,0 3,5 PEth, total PEth, 16:0/18:1 3,0 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 0,0 A-PEth,total B-PEth,total C-PEth,total A-PEth 16:0/18:1 B-PEth 16:0/18:1 C-PEth 16:0/18:1 40

41 Koncentration ( µmol/l) EQUALIS - B-Fosfatidyletanol (B-PEth) ,0 3,5 PEth, total A C 1,8 1,6 PEth 16:0 18:1 A C 3,0 1,4 2,5 2,0 1,5 1,2 1,0 0,8 0,6 1,0 0,4 0,5 0,2 0,0 A-HPLC A-LCMS A-LCMSMS C-HPLC C-LCMS C-LCMSMS 0,0 A-LCMS A-LCMSMS C-LCMS C-LCMSMS PEth, total för de positiva proven A och C med olika metoder. Strecket visar medelvärdet. PEth 16:0/18:1 för de positiva proven A och C med olika metoder. Strecket visar medelvärdet. 41

42 TACK! 42