Molekylärgenetisk diagnostik av akut bakteriell meningit Paula Mölling, PhD Molekylärbiolog
Bakteriell meningit hjärnhinneinflammation
Bakteriell meningit - etiologi Neonatal (<1mån) GrB strep, E. coli, L. mono Barn/ungdomar (<15år) N. men, S. pne Vuxna (>15år) N. men, S. pne, Staphylococcus Holland, 2008 (HiB och MenC vaccination) Mikrobiologen Örebro S.aur Övr L.mono Övr L.mono E.coli GrpB strep Hi S.pne GrpB strep S.pne N.men H.inflHi GrpB strep E.coli L.mono S.aur Övr S.pne N.men N.men
Från patient till provsvar Misstänkt meningit Ingen växt PCR
Mc Hi S. pne S. agal (GBS) L.mono 16S
Detektion av universella (U) och variabla (V) species specifika regioner i 16S rrna genen V1 V2 V6 V7 V8 V3 V4 V9 V5 U1 U2 U3 U4 U5 U6 U7 U8 1 bp 500 bp 1000 bp Alla bakterier S. pne Mc H. infl S. aga Alla streptokocker Listeria monocytogenes 1500 bp Steg 1 + UV Steg 2
MW VIII Prov 1 1+GBS Prov 2 2+GBS +K Provart: Likvor, blod, ledvätska, pleuravätska mm. 2 1:10 2 1:10 +K -K +GBS Steg 1: Steg 2a: Mc Hi Strep Bakterier= 1030 bp; = 710 bp = 540 bp = 300 bp Steg 2b: Pne = 937 bp S. aga = 544 bp L. mon = 265 bp
200 µl CSF Kromosomal DNA preparation RealtidsPCR: Streptococcus pneumoniae Haemophilus influenzae Streptococcus agalactiae (GBS) Listeria monocytogenes Neisseria meningitidis 16S rrna genen (U2-U3 )för ev. vidare sekvensering
Material Isolat av MC, HI, SP, GBS, LM n=327 Andra kliniska isolat n=89 Neisseria arter, Moraxella catarrhalis, H. parainf, P. multocida, legionella, Strept arter, enterokocker, S. aureus, S. haemolyticus, Salmonella, E. coli Kliniska prover n=185 odlings neg (50*+33**), odlings pos (20), konsekutiva (82) *tidigare labverifierade från 1999-2007 ** tidigare ej labverifierade
Metod DNA preparation MagNaPure Compact: Mutanolysin + MagNA Pure Bacteria Lysis Buffer (BLB), MagNA Pure Compact Nucleic Acid Isolation Kit I LightCycler PCR (ett och samma PCR program) MC ctra - capsular transport SP lyta - autolysin HI P6 outer membrane protein 6 GBS cfb - CAMP factor LM hly - hemolysin listeriolysin 16S U2-(V6)-U3 - universell/variabel region Duplex (Hybridiserings prober LC 640/705) SP/HI resp GBS/LM Simplex (Hydrolys prober FAM 530) MC resp 16S
Resultat detektionsnivå: Neisseria meningitidis 1 bakterie genom
Streptococcus pneumoniae 1 bakterie genom Haemophilus influenzae <10 bakterie genom
Streptococcus agalactiae (GBS) <10 bakterie genom Listeria monocytogenes <10 bakterie genom
16S rrna Neg 10 bakterier DNA sekvensering av 16S rrna kunde identifiera MC, HI, SP, GBS, LM med en tiopotens lägre känslighet
forts. Resultat MC 106*/107 HI 84/84 SP 99/99 GBS 23/23 LM 14/14 Tre H. parainfluenzae gav falskt positiva resultat med P6 (HI) dock med höga CP! *Det falskt negativa isolatet: 1 MC - utan kapsel Kan identifieras med sekvenseringen av genen för 16S rrna!!!!
forts. Resultat Kliniska prover n=185 odlings neg (50*+33) konsekutiva (82) *MC (n=16), SP (n=15), HI (n=1), GBS (n=2), LM (n=1) MC (n=4), SP (n=8), HI (n=2), GBS (n=1), LM (n=1) odlings pos (20): Culture results (no. of isolates) PCR results N. meningitidis (3) 3/3 ctra+ S. pneumoniae (7) 7/7 lyta+ H. influenzae (1) 1/1 p6+ S. agalatiae (2) 2/2 cfb+ Other bacteria (7), i.e. E. coli (1), S. aureus (1), 1 E. coli b, 1 unspecified staphylococci b CoNS a (1), unspecified staphylococci (2), Neisseria spp (1), unspecified streptococci (1)
Exempel från några rutinkörningar Inhibition? Spikning av prover + kontroll Spikade prover
Förekomst av bakteriellt DNA? 16S rrna-genen Patientprov 1 sekv. Patientprov 2 ej sekv. + kontroll - kontroller
Positiv för Neisseria meningitidis!!! Patientprov Mc+ Positiv kontroll Mc
Meningokocker kan orsaka epidemier Är sjukdomsfallen kopplade? Typning! Pilu s Kapsel sero/genogrupp LOS Rmp fhb p protei n Rmp PBP 2 CPS OM PG IMB Porin B serotyp Porin A - genosubtyp För utförligare utbrottsfrågeställningar kan även generna kodande för PorB, PBP2, FetA, fhbp och studeras samt PFGE och MLST
Metoder: Genetisk identifiering, gruppering och subtypning DNA preparation LightCycler PCR SP HI I* II* III GBS MC 16S LM * Endast på odlingsnegativa prover A C B Y W-135 Kapselgener VR1 VR2,3 pora, Kliniskt mikrobiologiska kliniken, Universitetssjukhuset Örebro
Mc identifiering Prober (ctra) Mc gruppering SYBR Green Mc subtypning SYBR Green A B C Y W-135 H 2 O Mc Mc H 2 O Cycler Temperatur (T) Temperatur (T) Sekvensering Mölling P, et al. J Clin Microbiol. 2002
F1 F2 Genosubtypning - pora VR1 R1 VR2 VR3 R2 Cyklisk sekvenserings PCR. ACTGTGACTGTT... Kapillär elektrofores PLQNIQPQVTKR Översättning till aminosyror (3 baser-1 aminosyra) P1.5,2,36-2 Namngivning av VR till genosubtyp http://neisseria.org/nm/typing/pora/ Mölling P, et al. APMIS 2000; Clarke SC, et al. Vaccine 2003
Metod: Pulsfält gel elektrofores (PFGE) Hela genomet Restriktions enzym (SpeI, NheI) delar upp genomet Genom fragmenten separeras fingeravtryck Mölling P, et al. J Clin Microbiol. 2001
Extra metoder: Genotypning - porb porb genen porb3 porb2 Realtids PCR SYBRGreen Internationell databas för Neisseria karaktärisering: http://neisseria.org/nm/typing/porb/ DNA sekvensering porb3:7,7,10,12,11,6. Genotyp
forts Extra metoder: typning pena (PBP2 förändringar nedsatt känslighet mot -laktam antibiotika) WT GEDGAEVVLRDRQGNIVDSLDSPRNKAPKNGKDIILSLDQRIQTLAYEELNKAVEYHQAKAGTVVVLDARTGEILALANTPAYDPNRPGRADSEQRRNRA WT2... M1... M2... M3... Sekvensering Neisseria meningitidis pena database: M4...K...NK...SV...Q.M...D...A..K...A...Q...V.S...Q..Q.N... M5 AGE...E...Q...V...E..K..Q... http://neisseria.org/perl/agdbnet/ WT VTDMIEPGSAIKPFVIAKALDAGKTDLNERLNTQPYKIGPSPVRDTHVYPSLDVRGIMQKSSNVGTSKLSARFGAEEMYDFYHELGIGVRMHSGFPGETA WT2... pena-allel 22, WT M1... M2...AQ...H...SSK...L...S. M3... M4...M...T...S..V.ATDTF..L...AT.Q...T...M.TPK...D..V... M5...D..N...AQ...SSK...L...S. 464 469 472 WT (n=32) GLLRNWRRWRPIEQATMSFGYGLQLSLLQLARAYTALTHDGVLLPVSFEKQAVAPQGKRIFKESTAREVRNLMVSVTEPGGTGTAGAVDGFDVGAKTGTA WT2 (n=1)... M1 (n=38)...k...vi.a...kk..e...a... M2 (n=1).a...qk...v...s...q..e... M3 (n=16)... M4 (n=1)... M5 (n=1).a...qk...a...q..e... 504 510 515 541 549 566 WT RKFVNGRYADNKHIATFIGFAPAKNPRVIVAVTIDEPTAHGYYGGVVAGPPFKKIMGGSLNILGISPTKPLTA-AAVKTPS* 581 WT2...T...* 581 M1..L...V...V...N...T...V...* 581 M2..L...V...* 581 M3..L...V.Y..V...N...T..V..QV...V...NV...* 582 M4...* 581 M5...* 581 501 501 501 501 501 501 501 Thulin, et al. AAC. 2006
10 20 30 40 50 60 70............................................................... WT1 (n=19) GTGCGGTGGACGGTTTCGATGTCGGCGCGAAAACCGGCACGGCGCGCAAGTTCGTCAACGGGCGTTATGCCGACAACA forts Extra metoder: WT2 (n=25)... typning - pena WT3 (n=1)... M1 (n=8)...t...t...c..a..t..a...t...t..ac.g...t..t..c...tg... M2 (n=4)...a..t...c...a...t...t...g..t...t...c.t...tt... M3 (n=4)...t...g..t...t...c.t...tt... M4 (n=3)...t...t...a...t...t...g..t...a..a..c.t...t... M5 (n=3)...t...t...c..a..t...t...t..ac.g..t..t..c..c...tg... M6 (n=2).c...a...t...t...g..t...a..a..c.t...tt... M7 (n=2).c...g..t...t...c.t...tt... M8 (n=2)...a..t...c...a...t...t...g...c.t...t... M9 (n=1)...t...t...c..a..t...t...t...g..t...t...c.t...t... M10 (n=1)...t...t...t...g..t...t...c.t...tt... M11 (n=1)...t...g..t...a..a..c.t...tt... M12 (n=1)...a..t...c...a...t...t...g..t...a..a..c.t...t... M13 (n=1)...a..t...c..a..t...t..t...t..ac.g...t..t...tg... M14 (n=1)...c...t...c..a..t...t...t..ac.g...t..c..c...tg... Pyrosekvensering 110 120 130 140................................. WT1 (n=19) TTTTGCCCCCGCCAAAAATCCCCGTGTGATTGTGGCGGTAA WT2 (n=25)...c... WT3 (n=1)...c... M1 (n=8)... M2 (n=4)...g..t...g... M3 (n=4)...g..t...g... M4 (n=3)...g... M5 (n=3)...g..t...g... M6 (n=2)...g..t...g... M7 (n=2)...g..t...g... M8 (n=2)...c... M9 (n=1)...a..t..t..g...g... M10 (n=1)...g..t...g... M11 (n=1)...t..t...g... M12 (n=1)...c... M13 (n=1)...c... M14 (n=1)...
forts Extra metoder: typning avfhbp och feta PCR Sekvensering Internationell databas för Neisseria karaktärisering: http://neisseria.org/nm/ FetA variable region http://neisseria.org/nm/ Factor H binding protein Jacobsson S, et al. Vaccine. 2006
Multi Locus Sequence Typing (MLST): 7 housekeeping gener DNA preparation abcz aroe adk fumc gdh pdhc pgm LightCycler PCR.ACTGTGACTGTT... DNA sekvensering ST-5 Sequence Type (ST) Jacobsson S, et al. http://www.mlst.net/ Scand J Infect Dis. 2008
Lokala utbrott av Mc bland tonåringar i Sverige 2006, Västerås Januari: 16 år man McC, typ T15, subtyp P1.7-2,16-29,35 14 år kvinna April: 17 år kvinna Vaccination av alla elever och lärare på 2 skolor 2009, Falun 10/9: 11 år man McC, typ T2a, subtyp P1.5-1,10-8,36-2 12/9: 18 år man 14/9: 19 år man Profylaktisk behandling av nära kontakter, ingen vaccinering
No. of cases 300 250 200 150 100 50 0 1970 Invasive meningococcal disease in Sweden 1970-2009 2000 Incidence 3 2 1 0 Year Antal fall Incidens/100 000/år
Tabell IV 2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008 2009 Totalt antal MC-isolat (ett per patient) 102 116 83 74 73 70 75 81 76 79 MC från blod/likvor 44 58 36 41 47 48 44 43 38 45 MC från luftvägar 56 55 43 27 24 19 28 34 35 24 MC från genitaltrakt 1 2 3 4 0 1 3 3 2 9 Andra invasiva MC 1 1 1 2 2 2 0 1 1 1 MC från CSF/blod serogrupp A 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 B 23 33 20 27 24 25 21 16 14 16 C 15 14 10 11 11 15 15 15 16 10 Y 1 8 4 2 6 4 5 9 7 16 W-135 5 2 1 1 5 1 2 2 1 1 annan 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0 ingen grupp 0 0 1 0 1 2 1 1 0 1, Kliniskt mikrobiologiska kliniken, Universitetssjukhuset Örebro
PCR resultat på odlingsnegativa prover: 2007 90 PCR-analyserade odlingsnegativa likvor: 6 Mc, 5 Pne, 2 Lm positiva. 2008 90 PCR-analyserade odlingsnegativa likvor: 5 Mc, 6 Pne, 2 Lm positiva 2009 89 PCR-analyserade odlingsnegativa likvor: 18 Mc, 1 Pne, 1 HI, 2 LM positiva (6 ledvätska, 15 DNA preparationer och resten likvor) OBS! Lab som skickar DNA preparation för MC gruppering/subtypning skicka istället likvorprov (gärna mer än 200 µl annars det ni har) pga att alla reningskit är ej kompatibla med den PCR vi kör med Roche LightCycler SYBR Green kit., Kliniskt mikrobiologiska kliniken, Universitetssjukhuset Örebro
Konklusion: varför använda genetisk karaktärisering? Snabb diagnos Vägledning av antibiotikabehandling Diagnostisera odlingsnegativa prover Under utveckling 16S optimering!!
Tack för mig!!! Medverkande Bakteriell meningit: Prof. Per Olcén Doc. Hans Fredlund Sara Thulin Hedberg, PhD För MC typningen även: Magnus Unemo, Susanne Jacobsson, Emma Johansson, Ronza Hadad