Slutrpport till SLU EkoForsk Skydd mot lgringssjukdomr i ekologiskt odlde äpplen Hilde Nybom 1, Ester Dey 2, Msoud Ahmdi-Afzdi 1,3 och Ibrhim Thir 3 1 Institutionen för växtförädling Blsgård, Sveriges lntbruksuniversitet, Fjälkestdsvägen 459, 29194 Kristinstd 2 Kemisk institutionen, Avdelningen för tillämpd biokemi, Lunds universitet, Box 124, 22100 Lund 3 Institutionen för växtförädling, Sveriges lntbruksuniversitet, Box 101, 23053 Alnrp 1
Förord Äpple är gott och nyttigt! Men det är inte lltid så lätt tt få tg i frisk och fin frukt, och sk den dessutom vr loklt odld med miljövänlig metoder så blir det ännu svårre. Lönsmheten för de svensk odlrn är problemtisk, med ett tuffre klimt än i mång ndr äppelproducernde länder och strk konkurrens från utländsk frukt. Lgersjukdomr orskde v olik svmpr är en v de viktigste nledningrn till tt ekologisk äppelodlingr hr ett signifiknt större bortfll v försäljningsbr frukt jämfört med nnn typ v odling. Även IP-odlingr kn drbbs v besvärnde skdor beroende blnd nnt på vilk äpplesorter mn odlr. Merprten v hittills utprovde icke-kemisk skyddsåtgärder hr hft otillräcklig effekt eller vrit dyrbr tt nvänd. Applicering v olik typer v beläggning på äpplen innn skörd hr dock vist sig h en viss potentil tt kunn motverk lgersjukdomr. Rågkli, som består v det yttre höljet kring rågkärnn, är en hittills underutnyttjd biprodukt v svensk rågsodling. Ur rågkli kn mn utvinn olik icke-toxisk fenol-lipider som exempelvis lkylresorcinoler (AR). En tvärvetenskplig forskrgrupp med kompetens inom äppelförädling och genetik (Professor Hilde Nybom, Blsgård, SLU), äppelodling och lgringssjukdomr (Dr Ibrhim Thir, Alnrp/Blsgård, SLU) smt tillämpd biokemi och industriell utveckling (Docent Ester Dey, Lunds universitet) bilddes 2011, och erhöll medel från SLU EkoForsk för ett tvåårigt projekt: Protection ginst storge diseses in orgniclly grown pples. Sedn nslöt sig även doktornden Msoud Ahmdi-Afzdi, som doktorerr på lgringssjukdomr hos äpple på SLU. Målsättningen hr vrit tt undersök om mn kn utveckl ett biologiskt preprt med lkylresorcinoler (AR) som ktiv beståndsdel. Dett preprt sk sedn kunn nvänds för tt besprut fruktträd så tt mn erhåller ett skydd mot svmpngrepp under fruktlgringen. Här redogör vi för erhålln resultt smt diskuterr hur mn kn gå vidre med dett projekt. Blsgård, Alnrp och Lund, oktober 2013 Projektgruppen 2
Innehållsförteckning Förord 2 Bkgrund 4 Mteril och metoder 5 AR utvinns ur rågkli och kvliteten kontrollers Lösningr med AR tillverks Äpplen inokulers med svmpsporer Först AR-försöket; juni 2011 teknikutveckling Andr AR-försöket; juli 2011 mer teknikutveckling Tredje AR-försöket; ugusti 2011 två utländsk äpplesorter tests Fjärde AR-försöket; oktober 2011 tre svensk äpplesorter tests Femte AR-försöket; två svmpr och fyr svensk äpplesorter tests Sjätte AR-försöket; myceltillväxt och virulens Sttistisk nlyser Resultt och diskussion 9 AR-lösningrn teknisk kvlitet Experimentell teknik. Effekt v 18 AR-lösningr på grönmögel hos två utländsk äpplesorter Effekt v fyr AR-lösningr på grönmögel hos tre svensk äpplesorter Effekt v två AR-lösningr på två svmpr hos fyr svensk äpplesorter Effekt v två AR-lösningr på myceltillväxt och virulens Slutstser och frmtidsutsikter 18 Referenser 19 Resulttförmedling från projektet 20 3
Bkgrund Skdor uppkomn vid kyllgring v äpple är en v de viktigste orskern till tt svensk äppelproduktion brotts med stor ekonomisk problem. Dess skdor kn uppgå till 10% eller mer v den inlgrde frukten och är speciellt förödnde eftersom odlren redn åsmkts betydnde kostnder för växtskyddsbehndling, gllring, skörd, sortering och lgring innn mn sedn tvings kst den förstörd frukten. Skdorn orsks främst v svmpsjukdomr som grönmögel Penicillium expnsum, bitterröt Colletotrichum gloeosporioides (Glomerell cingult), olik rter v Neofbre (N. lb och N. perennns; bull s eye rot, på svensk iblnd klld gloeosporiumröt eller Pezicul-röt) och gråmögel Botrytis cinere (Børve och Stensvnd 2007, Weber och Plm 2010). I Europ hr dess sjukdomr ökt signifiknt under senre år, snnolikt beroende på klimtförändringen (Amiri et l. 2008, Weber och Rolnd 2009). Vi kn lltså förvänt oss tt dess ngrepp kommer tt bli ännu llvrligre efterhnd som klimtet i Sverige blir llt vrmre och troligen även fuktigre under vegettionsperioden. Någr helt resistent äpplesorter finns inte dokumenterde men mn hr notert stor vrition melln sorter i ders tolerns för lgersjukdomrn (Thir och Nybom 2008, Thir et l. 2008, Ahmdi-Afzdi et l. 2013). De olik växtförädlingsprogrmmen för äpple runt om i världen hr hittills dock inte uppmärksmmt lgersjukdomr i någon högre grd. I flertlet stor äppelproducernde länder löser mn nämligen problemet genom tt helt enkelt dopp frukten i en fungicid efter skörden eller möjligen i ett biologiskt medel som BioSve vilket innehåller Pseudomons syringe. Även olik växtbserde oljor hr vist sig h skyddnde effekt (Amiri et l. 2008). Att dopp frukten i kemisk eller ndr medel är inte tillåtet i Sverige, vre sig för ekologiskt eller konventionellt odld frukt. Därigenom blir det än mer ngeläget tt lös problemet med lgersjukdomr, så tt inte svenskodld frukt konkurrers ut v den utlndsproducerde. Tidigre utförd odlings- och sortförsök inom äpple i Sverige (främst Blsgård och Kivik) hr vist tt just lgersjukdomr är en v de viktigste nledningrn till tt ekologisk odlingr hr ett signifiknt större bortfll v försäljningsbr frukt jämfört med nnn typ v odling (Thir och Nybom 2008, Thir et l. 2008). För den populär sorten Arom erhöll mn ett 20 gånger större bortfll i ekologiskt odlde träd jämfört med IP-odlde träd på smm fält (Jönsson et l. 2010). Det finns för närvrnde ing kemisk medel som är godkänd inom ekologisk odling för kontroll v lgersjukdomr hos äpple. Mikrobiologisk orgnismer som jästsvmpr och bkterier hr visserligen vist sig h effekt mot viss lgersjukdomr som grönmögel (Nunes et l. 2007, Jnisiewicz et l. 2008) men nvändningen v sådn preprt hr oftst sämre effekt på Neofbre som är den vnligste sjukdomen i Sverige, och kn h bieffekter som tt exempelvis orsk korkrost på sklet. Den tillåtn nvändningen v kemisk fungicider innn skörd blir lltmer begränsd även för IP-odlre, speciellt för odlingr belägn på vttenskyddsområden. Det senre gäller stor delr v Österlen dit merprten v den svensk äppelproduktionen är lokliserd. Ett nnt problem är tt flitig nvändning v de kemisk preprten hr resultert i resistent stmmr v de vnligste svmpsjukdomrn. Av de icke-kemisk metodern är behndling med hett vtten mest välkänt (Spdro et l. 2004, Neri et l. 2009) och ger god effekt även på Neofbre, men denn metod är kostndskrävnde och resultten är iblnd motsägelsefull eftersom mn kn få oönskde effekter som sklbränn. Olik äppelsorter skiljer sig dessutom åt i sin känslighet för värmebehndlingen som därför måste utforms individuellt för vrje sort. 4
Olik typer v beläggning på äpplen innn skörd hr en viss potentil tt kunn motverk lgersjukdomr. Rågkli, som består v det ytterst skiktet v rågkornet, är en hittills underutnyttjd biprodukt v svensk rågsodling. Ur rågkli (det yttre höljet runt rågkärnn) kn mn utvinn olik icke-toxisk fenol-lipider som exempelvis lkylresorcinoler (AR; Lndberg et l. 2008, Fig. 1). Dess ämnen ingår i en grupp v mycket intressnt ntioxidnter som hr en påvisd positiv effekt mot cncer, fetm, hjärt- och kärlsjukdomr smt dibetes typ 2 (Hjer et l., 2008, Andersson et l. 2011). AR från rågkli hr vist sig kunn inhiber tillväxt v olik brödsvmpr in vitro (Reiss 1989) smt minsk skdorn v olik växtptogen svmpr hos mngo (Droby et l. 1987, Hssn et l. 2007). Målsättningen för vårt rbete hr vrit tt undersök om mn kn minsk ngreppen v lgringssjukdomr hos äpple genom tt pplicer ett biologiskt preprt med lkylresorcinoler som ktiv beståndsdel. I frmtiden skulle i så fll dett preprt kunn nvänds för tt besprut fruktträd så tt mn erhåller ett skydd mot svmpngrepp under fruktlgringen. Fig. 1. Kemisk struktur för 5-(n)-lkylresorcinoler med olik cylkedjor Mteril och metoder AR utvinns ur rågkli och kvliteten kontrollers Vi inledde det experimentell rbetet vårvintern 2011 med tt utvinn lkylresorcinoler. Utgångsmterilet vr rågkli som inskffdes från Nord Mills i Mlmö, och som hde en prtikelstorlek på 0,5 1 mm. För tt frmställ en så ren produkt som möjligt, nvändes superkritisk koldioxidextrktion i två steg (Dey och Mikhilopulo 2009). Denn metod bygger på tt mn pplicerr ett mycket högt tryck så tt fsgränsen melln vätsk och gs luckrs upp. Den resulternde superkritisk vätskn kn både diffunder genom fst ämnen som en gs, och lös upp ämnen som en vätsk, och är därför ett synnerligen effektivt extrktionsmedel. Koncentrtionen v AR i den erhålln produkten kvntifierdes först med spektrofotometri. Därefter nvändes preprtiv högtrycksvätskekromtogrfi (HPLC), fstfs extrktion (SPE) och tunnskiktskromtogrfi (HPTLC) för tt kontroller kvliteten och fstställ den exkt mängden ren AR. 5
Lösningr med AR tillverks Därefter vr det dgs tt undersök vilk olik medel som kn nvänds i kombintion med AR för tt få en god effekt v ppliktion på frukt med spryning. Intorkde och noggrnt uppmätt mängder v AR-extrkt löstes upp i två olik lösningsmedel (Synperonic 91/6 respektive polydimetylsiloxn). Därefter tillsttes olik emulgeringsmedel (PEG 400, NCl, CCl 2 respektive Tween 20) och konsistensgivre (xnthn gum och gum rbic). Vrje lösning späddes sedn upp med destillert vtten till 30 ml, och kom därmed tt innehåll 0,025% respektive 0,05% AR. Lösningrn homogeniserdes med en Ultr Turrx (13,500 vrv per minut i en minut), och fotogrferdes i mikroskop för tt dokumenter droppstorleken. De färdig lösningrn förvrdes sedn i +8 C tills tt de skulle nvänds. Innn nvändning värmdes AR-lösningen upp till 37 C i 30 min, skkdes krftigt och fördes över till en spryflsk med vrs hjälp den sedn pplicerdes på frukten. Tbell 1. Innehållet i 19 olik AR-lösningr, som testdes på grönmögelinokulerd frukt. AR lösning Innehåll b c d e f g h i j k 1 0.025 0.1-0.5-0.2 1 2 2 5-2 0.025 0.2-0.5-0.2 1 2 1 2.5-3 0.025 0.1-1 - 0.2 1 0.5 2 2.5-4 0.025 0.2-1 - 0.2-0.5 1 2.5-5 0.025 0.1-1 - 1 1 2 2 5-6 0.025 0.2-0.5-1 - 0.5 1 2.5-7 0.025 0.1-1 - 1 1 2 2 2.5-8 0.025 0.2-2 - 1 1 2 2 5-9 0.025 0.1-1.5 1.5 2 1 5 10 0.025 0.1-1.5 1.5 2 0.5 5 11 0.025 0.1 - - 0.5 0.2 1 2 2-5 12 0.025 0.2 - - 0.5 0.2 1 2 1-5 13 0.025 0.05 - - 1 0.2 1-2 - 5 14 0.025 0.1 - - 1 0.2-0.5 1-5 15 0.025 0.05 - - 0.5 1 1-1 - 5 16 0.025 0.1 - - 0.5 1-0.1 2-5 17 0.025 0.05 - - 1 1-0.1 1-5 18 0.05 0.2 - - 0.5 0.2 1 2 2-5 131 0.025 0.2 0.15-0.5 0.2 1 2 2-5 Alkylresorcinoler, % (m/v); b xnthn gum, % (m/v); c gum rbic, % (m/v); d Synperonic 91/6, % (m/v); e polydimetylsiloxn, % (m/v); f Tween 20, % (m/v); g triolete, % (m/v); h oleyllkohol, % (m/v); i PEG 400, % (m/v); j CCl 2, % (m/v); k NCl, % (m/v). Äpplen inokulers med svmpsporer Eftersom det skulle bli tidsödnde och besvärligt tt mät effekten v AR på spontnt förekommnde svmpngrepp, vlde vi tt istället nvänd oss v frukt som inokulerts med svmpsporer enligt metoder som tidigre tillämpts inom vår forskrgrupp (Thir et l. 2009, Nybom et l. 2012). Aktivt växnde grönmögel i frukt v äpplesorten Arom flyttdes över till en petriskål med ett lämpligt medium för svmptillväxt (pottisdextros gr). Efter 10 dgrs tillväxt smldes konidiesporer upp med en glsstv och fördes över till en vttenlösning som filtrerdes och späddes till en koncentrtion v 100.000 sporer per ml. 6
Konidiesporer utvnns på smm sätt från ktivt växnde Neofbre perennns men här odldes svmpen istället på petriskålr med mltextrkt gr. All inokuleringrn utfördes på Blsgård. Frukten tvättdes först med vtten för tt vlägsn spontnt förekommnde ytlig svmpinfektioner. Sedn injicerdes 20 mikroliter v sporlösningen med en pipett, som stcks in c 4 mm i frukten. Vrje frukt inokulerdes på två sidor, och förvrdes sedn i rumstempertur tills tt sporlösningen torkt in. Först AR-försöket; juni 2011 teknikutveckling I juni 2011 genomfördes den först serien experiment med pplicering v AR på frukt. Vi nvände importerde Grnny Smith-äpplen, som inokulerdes med sporer v grönmögel. Vi inokulerde dels hel frukter och dels tunn skivor v frukten; tre frukter respektive tre fruktskivor nvändes för vrje försöksled. Fem sex timmr efter inokuleringen sprydes fruktern och fruktskivorn med en serie v 18 olik AR-innehållnde lösningr (AR 1 AR 18, Tbell 1). Efter sju dgr i rumstempertur, mättes ytn på den uppkomn skdn, dvs de synlig sjukdomssymptomen. Resultten för de hel fruktern blev utmärkt men det visde sig tt äppleskivorn blev så krftigt ngripn tt det inte gick tt kvntifier symptomen ordentligt. Andr AR-försöket; juli 2011 mer teknikutveckling Näst serie experiment utfördes på importerd frukt v Golden Delicious. Denn gång inokulerdes hel frukter, hlverde frukter smt fruktskivor med grönmögelsporer som ovn. Smm 18 lösningr nvändes som tidigre. Mängden symptom vlästes efter 6 dgr i rumstempertur. Återigen god resultt för de hel fruktern medn skdorn på fruktskivorn vr svårre tt utvärder. Därför beslöt vi tt fortsättningsvis rbet enbrt med hel frukter. Tredje AR-försöket; ugusti 2011 två utländsk äpplesorter tests I den tredje serien v experiment nvände vi importerd frukt v Royl Gl (mycket mottglig för grönmögel) och Golden Delicious (reltivt resistent mot grönmögel), vilk behndldes med 18 AR-lösningr som tidigre. Sex hel frukter v vrje sort nvändes för vrje försöksled. Vrje frukt sprydes med 10 ml rumstempererd AR-lösning. Vrje behndld frukt ldes sedn i en försluten plstlåd som plcerdes i en kylbox, 90% reltiv luftfuktighet och +2 C för tre veckors lgring. Därefter fick lådn med frukten stå i rumstempertur under ytterligre fem dgr för tt efterlikn hnteringen i hndelsledet. Dimetern på vrje svmpngrepp mättes med linjl i två vinkelrät riktningr vrefter medelvärdet nvändes som ett mått på ngreppets storlek. Fjärde AR-försöket; hösten 2011 tre svensk äpplesorter tests Under hösten 2011 fick vi äntligen tillgång till svensk frukt, och då vlde vi tt rbet med sortern Ingrid Mrie (gnsk mottglig för grönmögel), Gloster (gnsk resistent) och Frid (gnsk resistent). All frukt skörddes i en yrkesodling i Kivik. Mogndsstdiet fstställdes genom tt mät torrsubstnsinnehållet (sockerhlt), fstheten (med en penetrometer), utför ett jod-test (mäter stärkelsens omvndling till socker) smt produktionen v etylen (gskromtogrfi). Ingrid Mrie vr något mer mogen än övrig två men ll befnn sig fortfrnde i ett preklimkteriskt stdium lämpt för skörd v frukt som sk lgrs under en längre period. Hel frukter v de tre sortern inokulerdes med grönmögel. Eftersom smtlig hr både gult (skuggsid) och rött (solsid) på frukten, lde vi ett inokuleringsställe på skuggsidn och ett 7
på solsidn v vrje frukt. Fyr speciellt utvld AR-lösningr sprydes på den inokulerde frukten, smt även en kontrollösning (vtten). Dessutom ingick icke-spryde kontrollfrukter också i försöket. I vrje försöksled (sort x AR-lösning eller kontroll) ingick 15 frukter. Frukten förvrdes under 6 veckor i kyl respektive rumstempertur som ovn, innn symptomen vlästes. Femte AR-försöket, två svmpr och fyr svensk äpplesorter tests Bsert på de tidigre resultten för 2011, vldes de två mest lovnde AR-lösningrn ut för fortstt experiment. Båd dess lösningr innehåller 0.025% AR, 0.2% Tween 20, 1% triolete, 2% oleyllkohol och 2% PEG400. Dessutom innehåller den först lösningen (AR 1) även lösningsmedlet Synperonic 91/6 och 5% CCl 2 medn den ndr lösningen (AR 11) innehåller polydimetylsiloxn och 5% NCl. Frukt v fyr svenskodlde äpplesorter, Arom, Ingrid Mrie, Frid och Gloster, skörddes i Kivik på smm sätt som beskrivits ovn, med beräkning v mogndsstdium (stärkelseindex och Streif index) (Tbell 2). Dessutom mätte även färgen på sol- och skuggsid med hjälp v en kolorimeter. Tbell 2. Fruktens mogndsstdium och färg vid skörd. Streif index = fsthet/(torrsubstnshlt x stärkelseindex). Färgindex räkns ut enligt en formel bserd på mätvärden för röd färg, gul färg och ljushet. Säsong Sort Skörd Stärkelseindex Streif index Färgindex solsid skuggsid 2011 Arom Sept 10 4.1 0.17 4.4-4.0 Ingrid Mrie Sept 22 3.9 0.16 11.6 8.2 Frid Sept 26 4.1 0.17 9.3 6.8 Gloster Nov 11 4.7 0.17 8.9 5.0 2012 Arom Sept 18 4.4 0.16 17.8-3.1 Ingrid Mrie Okt 9 4.3 0.15 48.6-5.0 Frid Okt 18 4.2 0.16 25.2-1.1 Hösten 2011 inokulerdes fyr x 15 frukter med grönmögel för vrje äpplesort. För ll sorter utom Gloster upprepdes dess inokuleringr 2012, och då inokulerde vi även fyr x 15 frukter med Neofbre. Ett försöksled (15 frukter) för vrje svmp förblev ospryt som kontroll medn ett nnt sprydes med vtten. Övrig två försöksled sprydes med AR 1 respektive AR 11. Frukten lgrdes sedn i +2 C under 12 veckor. Skdorn på grönmögelinokulerd frukt mättes direkt efter uttg från lgret medn Neofbre-inokulerd frukt hölls i rumstempertur (+18 C och 80% reltiv luftfuktighet). Skdorn mättes sedn som ovn. Sjätte AR-försöket; svmpmyceltillväxt och virulens Petriskålr med pottisdextros gr utoklverdes och sedn tillsttes AR 1 eller AR 11 respektive inget lls (kontroll). Efter tre timmr vid 4 C tillsttes mycel v grönmögel till vrje petriskål. I näst försöksled tillsttes istället först svmpmycelet och tre timmr senre sprydes AR-lösningrn direkt på petriskålrn. På smm sätt tillsttes mycel v Neofbre och de två AR-lösningrn till petriskålr med mltextrkt gr. Av vrje försöksled tillverkdes minst tre petriskålr. Efteråt försegldes petriskålrn med prfilm och inkuberdes i 21 dgr vid +20 C. Efter de 21 dgrn gjordes en subjektiv uppskttning 8
v mängden svmpmycel i vrje petriskål, och effekten v AR-lösningrn beräkndes som procent myceltillväxt i behndlde petriskålr jämfört med myceltillväxten i kontrollskålrn. När vi hde utvärdert myceltillväxten, skrpde vi v konidiesporern från vrje petriskål och förde över dem i en vttenlösning. Denn filtrerdes och sedn beräkndes sporkoncentrtionen under mikroskop med hemcytometer. Lösningr med stndrdiserd sporkoncentrtion från vrje petriskål nvändes sedn till tt inokuler frukt v Arom på smm sätt som ovn. Till vrje sporlösning nvände vi fem äpplen. Dess frukter inkuberdes under en veck vid +20 C. Därefter mättes skdorns storlek som ovn. Slutligen beräknde vi AR-lösningrns effekt på skdeutvecklingen som procent v skdn på ospryd frukt. Sttistisk nlyser Skillnder melln försöksleden i mängden sjukdomssymptom undersöktes med olik typer v vrinsnlyser (onewy nov, multiwy nov, mixed model nov) v rcsin- och kvdrtrotstrnsformerde dt. Signifiknt skillnder melln medelvärden för de olik försöksleden fstställdes med Fisher s LSD respektive Tukey s HSD. Resultt och diskussion AR-lösningrn teknisk kvlitet Utbyte och kvlitet v AR bedömdes vr mycket tillfredsställnde. Men för tt verkligen h en hämmnde effekt på svmpens tillväxt, måste det färdig preprtet också fstn ordentligt på frukten, och stnn kvr tillräckligt länge. För tt uppnå dett, måste mn sätt till en del ämnen. Dess tillstser får dock inte hämm den ktiv substnsens verkn, inte vr toxisk, och heller inte för dyr. För tt det färdig preprtet sk kunn bli godkänt som ett växtstärknde medel inom ekologisk odling, måste ll ingående substnser dessutom vr cceptbl enligt regelverket. A B 10µm Fig. 2. Foto v två olik AR-lösningr i mikroskop, (A) AR 11 och (B) AR 131 som hr högre mängd konsistensgivre (xnthn gum och gum rbic). 9
De olik lösningrn i vår experiment skiljde sig märkbrt åt i droppstorlek och fysiklisk stbilitet (Fig. 2; dvs. om de olik komponentern börjr seprer eller om lösningen förblir homogen) men dett tycktes inte påverk lösningrns effektivitet i någon högre utsträckning. Experimentell teknik Vi testde olik metoder tt utför inokuleringrn och de påföljnde AR-spryningrn, och nvände därför hel frukter, hlverde frukter respektive skivor v frukt. Dessvärre visde det svår tt tolk resultten från hlverde frukter och skivor v frukt svårtolkde på grund v lltför ojämn svmptillväxt. Vi beslöt därför tt br nvänd den vnlig stndrdmetoden, dvs. inokulering v hel frukter (Fig. 3 och Fig 4). Fig. 3. Grönmögelinokulerde frukter v Golden Delicious. Fig. 4. Grönmögelinokulerde frukter v Ingrid Mrie: (1) frukt som spryts med AR 1, (wter) frukt som spryts med vtten, (control) frukt som inte spryts lls. 10
Effekt v 18 AR-lösningr på grönmögel hos två utländsk äpplesorter Importerd frukt v Royl Gl och Golden Delicious inokulerdes med grönmögel och behndldes därefter med 18 AR-lösningr (se Tbell 1 för smmnsättning v vrje lösning). Den genomsnittlig skdn blev 82 mm på obehndld kontrollfrukt v den mycket mottglig sorten Royl Gl och 59 mm på den något mer motståndskrftig Golden Delicious (Tbell 3). Den behndlde frukten fick signifiknt mindre skdesymptom men med mycket stor skillnder melln de olik AR-lösningrn. Bäst resultt, dvs krftigst inhibition, erhölls med AR 1, AR 2, AR 11 och AR 12, vilk producerde 92 100% inhibition hos Royl Gl och 63 87% inhibition hos Golden Delicious. Även AR 6 och AR 13 hde god effekt på grönmögelskdorn hos båd äpplesortern. Tbell 3. Appliktion v 18 AR-lösningr smt storlek på de resulternde grönmögelskdorn i mm respektive i % v skdns storlek jämfört med skdn på ospryd kontrollfrukt. AR- Royl Gl Golden Delicious lösning Skdns storlek Inhibition Skdns storlek Inhibition (%) (mm) (%) (mm) Kontroll 82 z 0 59 0 1 4 hi 95 8 k 87 2 7 hi 92 11 jk 81 3 71 b 13 20 efgh 67 4 51 de 38 23 cde 61 5 57 cd 31 20 efgh 67 6 14 gh 83 15 ij 74 7 58 cd 30 24 bcd 59 8 63 bc 23 16 ghi 73 9 50 de 39 28 b 53 10 48 de 41 25 bc 58 11 0 i 100 22 cde 63 12 0 i 100 17 fghi 71 13 23 g 72 11 jk 81 14 58 cd 30 16 hi 74 15 55 cd 33 10 k 84 16 50 de 39 21 cdef 65 17 44 ef 46 20 defg 66 18 34 cdef 58 15 ij 75 Z Medelvärden som följs v olik bokstäver, inom smm kolumn, skiljer sig åt signifiknt, p 0.05. Effekt v fyr AR-lösningr på grönmögel hos tre svensk äpplesorter Hösten 2011 hde äntligen den svensk frukten mognt, så tt vi kunde test tre viktig hndelssorter i Sverige, nämligen Ingrid Mrie, Gloster och Frid. Denn gången testdes br fyr AR-lösningr (Tbell 4). AR 1 och AR 11 hde redn producert mycket god resultt i föregående försök, och skiljer sig br i vlet v lösningsmedel smt tillsts v CCl 2 respektive NCl. Dessutom nsåg vi tt AR 18, som innehåller dubbelt så hög koncentrtion v AR som övrig, också kunde vr intressnt liksom den tidigre ej provde AR 131 som hr högre mängd konsistensgivre (både xnthn gum och gum rbicum) än övrig lösningr och som hde vist bättre fysiklisk-kemisk stbilitet. Av dess fyr ARlösningr vr det dock br AR 1 som skiljde sig signifiknt från övrig (Fig. 5), med 33% inhibition för Ingrid Mrie, 59% för Frid och 62% för Gloster. Någr genomgående 11
skillnder på storleken hos skdor på fruktens solsid respektive fruktens skuggsid kunde vi inte se (Tbell 4). Tbell 4. Appliktion v 4 AR-lösningr smt storlek på de resulternde grönmögelskdorn i mm respektive i % v skdns storlek jämfört med skdn på ospryd kontrollfrukt. ARlösning Ingrid Mrie Frid Gloster Ingrid Mrie Frid Gloster Skd Inhibition Skd Inhibition Skd Inhibition 1 y 2 y 1 y 2 y 1 y 2 y (mm) (%) (mm) (%) (mm) (%) Obehndld 31.5 b 0 31.0 0 31.0 0 34 29 34 28 33 29 Vtten 39.0-3 33.0-7 24.5 b 20 39 39 35 31 27 22 1 21.0 c 33 12.5 b 59 11.5 c 62 20 22 13 12 11 12 11 22.5 bc 17 14.5 b 54 16.5 bc 46 19 26 17 12 16 17 131 20.5 c 33 19.0 b 40 16.0 c 49 21 20 22 16 14 18 18 20.5 c 35 - - 17.5 bc 43 23 18 17 18 1 y Skdns storlek i mm på fruktens skuggsid; 2 y Skdns storlek i mm på fruktens solsid Z Medelvärden som följs v olik bokstäver, inom smm kolumn, skiljer sig åt signifiknt, p 0.05. 25 20 Lesion dimeter (mm) 15 10 b 5 1 11 131 18 0 ARs solutions Fig. 5. Jämförelse v AR-lösningrns förmåg tt inhiber grönmögelskdor hos tre olik äpplesorter. Stplrn nger medelvärdet för skdns storlek på frukt som spryts med AR 1, AR 11, AR 131 respektive AR 18. Stplr med olik bokstäver skiljer sig åt signifiknt (p 0.05). Här hr vi slgit smmn värden för ll tre äpplesortern och de två inokuleringsställen på vrje frukt (solsidn och skuggsidn). Vi fnn emellertid en signifiknt interktion melln AR-lösningr och inokuleringsställe p 0.001, och melln AR-lösningr och olik äpplesorter p 0.007, och melln AR-lösningr, inokuleringsställe och sorter p 0.024. 12
Effekt v två AR-lösningr på två svmpr hos fyr svensk äpplesorter De fyr äpplesortern vr skördde i smm mogndsstdium men skiljde sig åt mrknt i mottglighet för de båd svmpsjukdomrn, och det vr dessutom inte någon smstämmighet melln sorterns mottglighet för de två olik svmprn (Fig. 6). Arom vr sålund den sorten som vr mest mottglig för grönmögel men den vr ändå betydligt mindre mottglig för Neofbre jämfört med Ingrid Mrie och Frid. 60 A 50 A Skdns dimeter (mm) 40 30 20 b b c B Ingrid Mrie Frid Arom Gloster 10 0 Penicillium expnsum Neofbre perennns Fig. 6. Mottglighet för grönmögel, beräknt som genomsnittlig storlek på den resulternde skdn hos frukt som inokulerts med grönmögel respektive Neofbre. Stplr med olik bokstäver skiljer sig åt signifiknt (p 0.05). De olik sortern skiljde sig också åt när det gäller grden v det skydd som AR-lösningrn kunde ge (Tbell 5, Fig. 9). Jämfört med ospryd frukt, inhiberdes skdorn v grönmögel med 17, 28, 39 respektive 52% för Arom, Ingrid Mrie, Frid och Gloster (Fig. 7). För Neofbre, blev inhibitionen 77, 74 respektive 31% för Arom, Ingrid Mrie och Frid (Gloster vr inte med i denn delen v försöket) (Fig. 8). 13
Fig. 7. Grönmögelinokulerde frukter v Ingrid Mrie: (1) (control) frukt som inte spryts lls, (11) frukt som spryts med AR 11, (1) frukt som spryts med AR 1. Fig. 8. Neofbre-inokulerde frukter v Arom: (1) (control) frukt som inte spryts lls, (11) frukt som spryts med AR 11, (1) frukt som spryts med AR 1. 14
Inhibition % 60 50 40 30 20 10 0 Penicillium expnsum b bc c Arom Ingrid Mrie Frid Gloster 90 70 Neofbre perennns Inhibition % 50 30 10 b -10 Arom Ingrid Mrie Frid Fig. 9. Genomsnittlig procentuell inhibition v svmpskdor efter behndling med de två ARlösningrn. Stplr för smm svmp men med olik bokstäver, skiljer sig åt signifiknt (p 0.05). Generellt kn mn konstter tt sorter med reltivt liten mottglighet för en viss svmpsjukdom på kontrollfrukten också drog mest nytt v skyddet från AR-lösningrn (Tbell 5). Omvänt kn mn också utryck det som tt sorter med störst behov v skydd tyvärr vr svårst tt skydd. Skdorn vr genomgående något mindre på solsidn v fruktern, men skillnden vr signifiknt endst för skdorn v Neofbre hos Arom (Tbell 5). Tidigre studier hr vist tt solsidn på äpplen vnligen innehåller mer ntocyner och vx, och är mer motståndskrftig mot svmpsjukdomr (Thir et l. 2009). I ndr studier hr olik äpplesorter dock skiljt sig åt i reltiv känslighet för solsid och skuggsid, och det verkr svårt tt dr någr generell slutstser (Ahmdi-Afzdi et l. 2013). 15
Tbell 5. Appliktion v 2 AR-lösningr smt storlek på skdorn i mm för fyr äpplesorter och två svmpr (P.e Penicillium expnsum, N.p Neofbre perennns). Genomsnittlig skdn på solsid respektive skuggsidn uppges också. En interktion melln olik prmetrr vr signifiknt: behndling x sid för Arom inokulerd med Neofbre. Behndling Ingrid Mrie Frid Arom Gloster P.e N.p P.e N.p P.e N.p P.e 10 ml ARs 1 20.0 c z 9.6 b 20.0 b 30.3 b 37.5 b 1.0 c 11.6 b 10 ml ARs 11 28.1 b 13.6 b 22.1 b 32.7 b 45.2 14.0 b 16.6 b 10 ml wrm wter 35.0 46.7 35.1 50.0 46.5 32.1 29.6 Kontroll 33.0 45.2 34.2 49.0 50.3 31.0 30.8 Solsid 29.0 39.0 26.5 39.0 44.2 17.5 b 21.4 Skuggsid 29.0 42.0 29.5 42.0 45.7 21.5 22.9 Behndling x sid Ns Ns Ns Ns Ns * NS Behndling x säsong Ns Ns Ns Ns Ns Ns Ns Z Medelvärden som följs v olik bokstäver, inom smm kolumn, skiljer sig åt signifiknt, p 0.05 Ns = inte signifiknt Effekt v två AR-lösningr på myceltillväxt och virulens Tillsts v AR-lösningrn till petriskålr tre timmr innn mycelet fördes över, resulterde i en sämre myceltillväxt under de påföljnde tre veckorns inkubtion, men effekten vr signifiknt endst för AR 1-behndlde petriskålr med Neofbre (Tbell 6). Betydligt krftigre inhibition erhölls när vi spryde AR-lösningrn på petriskålrn tre timmr efter tt svmpmycelet tillstts (Fig. 10). Särskilt AR 1 utmärkte sig, med 71 och 77% inhibition v myceltillväxten hos grönmögel respektive Neofbre (Tbell 6). Fig. 10. Myceltillväxt hos grönmögel: (control) petriskålr som inte spryts, (1) petriskålr som spryts med AR 1 tre timmr efter tt mycelet tillstts, (11) petriskålr som spryts med AR 11 tre timmr efter tt mycelet tillstts. 16
Tbell 6. AR-lösningrns effekt på myceltillväxt in vitro v P. expnsum respektive N. perennns på petriskålr med pottisdextros gr (PDA) respektive mltextrkt gr (MEA). Svmp Behndling AR tillstt 3 tim innn inokul. AR spry 3 tim efter inokul. Symptom Inhibition Symptom Inhibition (mm) (%) (mm) (%) P. expnsum ARs 1 69.0 b z 24.0 24.3 c 71.0 ARs 11 72.0 b 21.0 41.7 b 50.0 b Kontroll 90.7 83.3 N. perennns ARs 1 31.3 b 46.0 10.3 c 77.0 ARs 11 42.0 b 27.5 b 25.3 b 43.0 b Kontroll 58.0 44.3 Z Medelvärden som följs v olik bokstäver, inom smm kolumn och svmp, skiljer sig åt signifiknt, p 0.05 När vi därefter inokulerde Arom äpplen med inokulum som vi fått genom tt skrp v sporer från de AR-spryde petriskålrn, fick vi signifiknt mindre skdor än när vi nvände sporer från obehndlde kontroll-petriskålr (Fig. 11). AR-behndlingrn hde lltså förmåg tt begräns svmprns virulens. För grönmögel, visde AR 1 bäst förmåg tt begräns virulensen medn de två AR-lösningrnn inte skiljde sig åt i sin förmåg tt begräns virulensen hos Neofbre. När vi inokulerde Arom äpplen med sporer som vi istället fått från petriskålr där AR-lösningrn tillstts innn mycelet, fick vi ing signifiknt begräsningr v virulensen för någon v svmprn (Fig. 12). 60,0 50,0 Skdns dimeter (mm) 40,0 30,0 20,0 10,0 c b A B B Kontroll ARs 1 ARs 11 0,0 Penicillium expnsum Neofbre perennns Fig. 11. Effekt v AR 1 och AR 11 på virulensen hos grönmögel och Neofbre, beräknd som storleken v skdor på frukter v Arom. Dess frukter hde inokulerts med sporer från petriskålr som spryts med AR-lösningr tre timmr efter tt de först försetts med svmpmycel. Stplr för smm svmp men med olik bokstäver, skiljer sig åt signifiknt (p 0.05). 17
Skdns dimeter (mm) 50,0 40,0 30,0 20,0 10,0 A A Kontroll ARs 1 ARs 11 A 0,0 Penicillium expnsum Neofbre perennns Fig. 12. Effekt v AR 1 och AR 11 på virulensen hos grönmögel och Neofbre, beräknd som storleken v skdor på frukter v Arom. Dess frukter hde inokulerts med sporer från petriskålr som hde behndlts med AR-lösningr tre timmr innn de försetts med svmpmycel. Stplr för smm svmp men med olik bokstäver, skiljer sig åt signifiknt (p 0.05). Slutstser och frmtidsutsikter Vi hr nu utfört ett ntl försök med smmnlgt 19 olik AR-lösningr, som vi spryt på frukter som strx dessförinnn inokulerts med grönmögel eller Neofbre. Merprten v dess lösningr hr resultert i signifiknt minskde skdor på frukten jämfört med kontrollfrukt som inte behndlts lls eller br spryts med vtten. Den effektivste lösningen hittills är AR 1, men det finns ytterligre någr ndr som vist genomgående signifiknt minskde sjukdomssymptom. AR 1 hr också vist god förmåg tt begräns såväl myceltillväxt in vitro som virulens hos konidiesporer bildde på mycel i behndlde petriskålr. Innn vi kn initier ett mer storskligt utvecklingsrbete v AR som växtstärknde medel för kontroll v lgringssjukdomr, måste vi även h dt från fältförsök. Det är ju viktigt tt t red på i vd mån AR-lösningrn kn skydd även frukter med nturlig svmpinfektioner, och om en pplicering i fält kn ge skydd fler veckor/månder senre under lgringsperioden. Ett litet pilotprojekt hr därför utförts 2013, med nio träd v Arom. Tre v dess sprutdes md AR 1 (500 ml/träd) i full blom (ndr veckn i mj) och tre veckor innn skörd (15:e ugusti). Tre träd sprutdes endst vid det ndr tillfället och de övrig tre träden sprutdes inte lls (kontroll). Frukten skörddes i september enligt mogndsindex. Frukt från vrt och ett v försöksleden deldes upp i tre grupper. Den först gruppen sprydes med AR 1. Frukten i övrig två grupper inokulerdes med grönmögel. Den en v dess grupper sprydes dessutom med AR 1 strx efter inokuleringen. Utvärderingen är inte klr ännu, men en preliminär utvärdering tyder på tt mängden fruktmögel (Monili spp) är mindre i träd som behndlts med AR 1. Denn typ v fältförsök bör uppreps i större skl, med fler äpplesorter och med inokulering v den skördde frukten med fler svmpsjukdomr. 18
Referenser Ahmdi-Afzdi M, Thir I, Dey ES, Nybom H. 2013. Alkylresorcinols (AR) isolted from rye brn cn protect pples from fungl storge diseses. Poster t VIPCA Conference on Plnt Genetics nd Breeding Technologies in Vienn, Austri. Ahmdi-Afzdi M, Thir I, Nybom H. 2013. Impct of hrvesting time nd fruit firmness on the tolernce to fungl storge diseses in n pple germplsm collection. Posthrvest Biol. Technol. 82: 51 58. Amiri A, Dugs R, Pichot A, Bompeix G. 2008. In vitro nd in vitro ctivity of eugenol oil (Eugeni cryophyllt) ginst four importnt posthrvest pple pthogens. Int. J. Food Microbiol. 126: 13 19. Andersson U, Dey SE, Holm C, Degermn E. 2011. Rye brn lkylresorcinols supress dipocytes lipolysis nd hormon-sensitive lipse ctivity. Molec. Nutrition Food Res. 55: S290 S293. Børve J, Stensvnd A. 2007. Colletotrichum cuttum found on pple buds in Norwy. Plnt Helth Progress doi, 10.1094/PHP-0522-01-RS. Dey ES, Mikhilopulo K. 2009. A food grde pproch for the isoltion of mjor lkylresorcinols (ARs) from rye brn pplying tilored supercriticl crbon dioxide (scco2) extrction combined with HPLC. J. Supercrit. Fluids 51: 167 173. Dey ES, Ahmdi-Afzdi M, Nybom H, Thir I. 2013. Alkylresorcinols isolted from rye brn by supercriticl fluid of crbon dioxide nd suspended in food-grde emulsion show ctivity ginst Penicillium expnsum on pples. Arch. Phytopthol. Plnt Protect. 46: 105 119. Droby S, Prusky D, Jcoby B, Goldmn A. 1987. Induction of ntifungl resorcinols in flesh of unripe mngo fruits nd its reltion to ltent infection by Alternri lternt. Physiol. Mol. Plnt Pthol. 30: 285 292. Hjer GR, vn Heften TW, Visseren FLJ. 2008. Adipose tissue dysfunction in obesity, dibetes, nd vsculr diseses. Europ. Hert J. 29: 2959 2971. Hssn MK, Dnn EK, Irving DE, Cotes LM. 2007. Concentrtion of constitutive lk(en)ylresorcinol in peel of commercil mngo vrieties nd resistnce to posthrvest nthrcnose. Physiol. Mol. Plnt Pthol. 71: 158 165. Jnisiewicz WJ, Sftner RA, Conwy WS, Yoder KS. 2008. Control of blue mold decy of pple during commercil controlled tmosphere storge with yest ntgonists nd sodium bicrbonte. Posthrvest Biol. Technol. 49: 374 378. Jönsson Å, Nybom H, Rumpunen K. 2010. Fungl disese nd fruit qulity in n pple orchrd converted from integrted production to orgnic production. J. Sustin. Agricult. 34: 15 37. Lndberg R, Andersson AAM, Amn P, Kml-Eldin P. 2009. Comprison of GC nd colorimetry for the determintion of lkylresorcinol homologues in cerel grins nd products. Food Chemistry 113: 1363 1369. Levi F, Psche C, Lucchini F, Chtenoud L, L Vecchi C. 2000. Refined nd whole grin cerels nd the risk of orl, desophgel nd lryngel cncer. Eur. J. Clin. Nutr. 54: 487 498. Neri F, Mri M, Brigti S, Bertolini P. 2009. Control of Neofbre lb by plnt voltile compounds nd hot wter. Posthrvest Biol. Technol. 51: 425 430. Nybom H, Ahmdi-Afzdi M, Grkv-Gustvsson L, Sehic J, Thir I. 2012. Selection for improved fruit texture nd storbility in pple. Act Horticult. 934: 849 854. Reiss J. 1989. Influence of lkylresorcinols from rye nd relted compounds on the growth of food-borne molds. Cerel Chem. 66: 491 493. 19
Spdro D, Gribldi A, Gullino ML. 2004. Control of Penicillium expnsum nd Botrytis cinere on pple combining biocontrol gent with hot wter dipping nd cibenzolr- S-mthyl, bking sod, or ethnol ppliction. Posthrvest Biol. Technol. 33: 141 151. Thir I, Nybom H. 2008. Jämförnde försök med skorvresistent äpplesorter. Fkt från Prtnerskp Alnrp, 8, 1 4. Thir II, Jönsson Å, Nybom H. 2008. Äpplesorter för ekologisk odling. Frukt & Bär 2008 (10): 18 21. Thir II, Johnsson E, Olsson ME. 2009. Improvement of pple qulity nd storbility by combintion of het tretment nd controlled tmosphere storge. HortScience 44: 1648 1654. Weber RWS, Rolnd WS. 2009. An evlution of possible effects of climte chnge of pthogenic fungi in pple production using fruit rots s exmples. Erwerbsobstbu 51: 115 120. Weber RWS, Plm G. 2010. Resistnce of storge rot fungi Neofbre perennns, N. lb, Glomerell cutt nd Neonectri glligen ginst thiophnte-methyl in Northern Germn pple production. J. Plnt Dis. Protect. 117: 185 191. Zinuri DE, Irving EK, Dnn LM, Cotes A, Wering H. 2013. Alk(en)ylresorcinol concentrtions in Kensington Pride mngo peel nd ntifungl ctivity ginst Colletotrichum gloeosporioides. Act Hortic. 975: 217 222. Resulttförmedling från projektet Ahmdi-Afzdi M, Thir I, Dey ES, Nybom H. 2012. Resistnce nd protection of pples from storge diseses. 2 nd Symposium on Horticulture in Europe, 1 5 juli, Angers, Poster. Ahmdi-Afzdi M, Thir I, Dey ES, Nybom H. 2012. Alkylresorcinols isolted from rye brn cn protect pples from fungl storge diseses. Interntionl Conference on Plnt Breeding nd Breeding Technologies, 16 19 februri 2013, Wien, Poster. Dey ES, Ahmdi-Afzdi M, Nybom H, Thir I. 2013. Alkylresorcinols isolted from rye brn by supercriticl fluid of crbon dioxide nd suspended in food-grde emulsion show ctivity ginst Penicillium expnsum on pples. Arch. Phytopthol. Plnt Protect. 46: 105 119. Thir I, Ahmdi-Afzdi M, Nybom H, Dey ES. Alkylresorcinols isolted from rye brn inhibit growth of Penicillium expnsum nd Neofbre perennns in vitro nd on funglinoculted fruits of four pple cultivrs. Mnuskript insänt. Dessutom hr projektet presenterts vid ett ntl seminrier med odlre, rådgivre och/eller forskre som målgrupper, t ex Äppeldgen på SLU 2012-02-09 (http://www.slu.se/sv/fkulteter/ltj/om-fkulteten/institutioner- /vxtskyddsbiologi/forskning /integrert-vxtskydd/). 20