Handläggning av Cytomegalvirusinfektioner

Bakgrundsdokumentation Artiklar publicerade under rubriken Bakgrundsdokumentation är författarnas manuskript. Budskapet i dessa delas därför inte alltid av expertgruppen. Antivirala medel mot CMV, verkningsmekanismer och resistensutveckling Antivirala medel mot cytomegalvirus (CMV) Tre antivirala medel (ganciklovir, foscarnet och cidofovir) används idag vid systemisk antiviral behandling av CMV-infektioner (se Figur 1 och Tabell I). Figur 1. Strukturformler MIA BRYTTING Tabell I. Tillgängliga antiviraler mot CMV-infektion (1,2) Substans Produktnamn Aciklovir (ACV) Aciklovir, Geavir Zovirax Adm. * Farmakologi Viktiga biverkningar IV Per oralt Oral biotillgänglighet, 10-20% Halveringstid i plasma, 2-3 tim. Halveringstid för PPP-ACV, 1-2 tim. Nedsätter njurfunktionen Valaciklovir Valtrex IV Per oralt Oral biotillgänglighet, 54% Halveringstid i plasma, 2-3 tim. Halveringstid för PPP-ACV, 1-2 tim. Nedsätter njurfunktionen Ganciklovir (GCV) Cymvene IV Per oralt Intravitr Oral biotillgänglighet, 8-9% Halveringstid i plasma, 2,5 tim. Halveringstid för PPP-GCV, 12 tim. Benmärgssupprimerande Nedsätter njurfunktionen Cidofovir (CDV) Vistide IV Intravitr Oral biotillgänglighet, 10-20% Halveringstid i plasma, 3 tim. Halveringstid för PP-CDV, 24-65 tim. Nedsätter njurfunktionen Foscarnet Foscavir IV Intravitr Oral biotillgänglighet, 0% Halveringstid i plasma, 6 tim. Nedsätter njurfunktionen Fomivirsen Vitravene Intravitr Halveringstid i öga, 45-78 tim. Okulära biverkningar. * Administrationsväg, intravenöst (IV), per oralt och/eller intravitrialt (intravitr). Info från Läkemedelsverket 7/8:2001 19

Utöver dessa tre medel kan aciklovir användas som profylax mot CMV-infektioner. Ganciklovir och aciklovir/valaciklovir är nukleosidanaloger som kräver monofosforylering av CMV-kinaset (pul97). Dioch trifosforylering sker med cellulära enzymer (se Figur 2). Figur 2. Verkningsmekanismerna (virala proteiner är understrukna) Aciklovir fosforyleras sämre av CMV-pUL97 än ganciklovir och därför uppnås sämre antiviral effekt vid behandling av aciklovir (1). Valaciklovir är en prodrog med bättre biotillgänglighet än aciklovir, och antiviral effekt för CMV kan uppnås vid peroral behandling (1). Cidofovir är en nukleotidanalog som endast kräver fosforylering av cellulära enzymer. De fosforylerade produkterna verkar hämmande på virusreplikationen via CMV DNA polymeraset (2). Fosforylerat aciklovir stoppar syntesen av DNA-kedjan vid inkorporering istället för det naturliga substratet dgtp (1). De fosforylerade cidofovir- och ganciklovirprodukterna tävlar med de naturliga substraten (dctp respektive dgtp), och vid inkorporering blir replikationshastigheten nedsatt och den syntetiserade DNA-kedjan klyvs (1,2). Foscarnet är en pyrofosfatanalog som hämmar det virala DNApolymeraset direkt genom blockering av pyrofosfatbindande stället (1). Fomivirsen är en antisense-oligonukleotid (fosforotioat-oligonukleotid) som kan användas vid lokal behandling av CMV-retinit (2). Denna oligonukleotid är komplementär till mrna från Immediate Early Region 2 (IE2) av CMV (2). Genom att den binder till mrna blockeras translationen för detta regulatoriska protein och replikationen av infektiös CMV inhiberas (se Figur 3). Resistens Det är främst transplantationspatienter och HIV-infekterade patienter som behandlas för CMV-infektioner. Problem med antiviralresistens skiljer sig mellan dessa patientkategorier. HIV-patienter behöver ofta långvarig behandling av CMV-infektionen. Transplantationspatienterna behandlas ofta med anti-cmv-profylax och, vid uppkommen CMV-infektion, antiviral behandling under en begränsad tid. Det är främst HIV-patienter som utvecklar resistens mot CMV eftersom resistensutveckling är beroende av tiden för antiviral behandling, mängden virus vid start av behandlingen, samt immunstatus hos patienten (3). Dålig effekt av antiviral behandling kan orsakas av antiviral resistens (virus har nedsatt känslighet för drogen) samt klinisk resistens (virus är känsligt för drogen men terapin sviktar av annan orsak). Klinisk resistens kan uppstå vid suboptimal behandling av CMV-infektion lokaliserad i platser med dålig biotillgänglighet för drogen till exempel öga och CNS, vid behandling av patienter med dålig immunstatus samt vid behandling av patient med hög virusmängd (3). Antiviral resistens orsakas av genetiska förändringar. Man kan analysera antiviral resistens med fenotypiska och genotypiska metoder (4,5). Vid fenotypisk analys kan CMV antiviral känslighet studeras genom mätning av plackformation, CMV-replikation via DNA-hybridisering eller antigenuttryck i närvaro av olika koncentrationer av antiviral drog. Virus känslighet för den antivirala drogen anges som IC50 (50% inhiberande koncentration). Vid denna koncentration av antiviral drog inhiberas antigenuttryck/dna-uttryck/plackformationen till hälften. På grund av den långa replikationstiden är de fenotypiska metoderna långsamma samt arbetskrävande. I Sverige utförs fenotypisk analys av CMV antiviral känslighet endast av Smittskyddsinstitutet. Vid genotypisk analys studeras generna som kodar för det virala kinaset (pul97) och/eller DNA-polymeraset (4,5). Utöver sekvensering av CMV DNA polymerasgenen och UL97-genen har det utvecklats flera snabba PCR-baserade metoder där mutationer påvisas genom förändrad restriktionsezymsklyvning eller med hybridiseringsspecifika prober (5). En genotypisk analys tar cirka två dagar. Idag finns goda kunskaper om vilka mutationer som påverkar antiviralkänsligheten. Genotypisk analys av DNA-polymeras och UL97-genen sker idag på Smittskyddsinstitutet (DNA-polymerasegenen endast i forsk- Figur 3. Sekvens och verkningsmekanism för fomivirsen 20 Info från Läkemedelsverket 7/8:2001

ningssyfte). Analys av UL97-genen kommer sannolikt utföras på fler laboratorier inom snar framtid. Resistens mot ganciklovir och aciklovir uppkommer främst genom mutationer i CMV-pUL97, men även mutationer i det virala DNA-polymeraset kan orsaka ganciklovir- och aciklovirresistens (4,5). Resistens mot cidofovir och foscarnet orsakas av muterat CMV DNA polymeras. Känsligheten för dessa medel påverkas inte av förändrat CMV-pUL97. Alla mutationer i pul97 och DNA-polymeras orsakar inte resistens, utan ibland kan kombinationer av mutationer vara orsaken. Det virala kinaset pul97 är ett serin/treoninkinas. Kinaset har proteinkinas aktivitet samt låg nukleosidkinasaktivitet. Förändringar i platsen som katalyserar proteinkinasaktivitet orsakar försämrad växt. Studier har visat att muterat pul97 redan från början finns i patientens virus population (6). Vid behandling med ganciklovir (oralt eller intravenöst) selekteras de resistenta stammarna. Man har funnit att frekvensen ganciklovirresistens stiger från 8% efter tre månaders behandling med ganciklovir till 11% efter sex månader, 28% efter nio månader och 64% vid 15 månaders behandling (7,8). Man har även funnit 0,5-0,8% av CMV-isolaten från obehandlade patienter är ganciklovirresistenta på grund av förändrat pul97 (8,9). Man har ännu inte funnit att aciklovirprofylax orsakar pul97 mutationer. Mer än 95% av ganciklovirresistenta CMV-isolat har förändrat pul97 (10). Alla de identifierade mutationerna/deletionerna som orsakar ganciklovirresistens ligger inom aminosyra (aa) 460-607 i pul97. Totalt har förändringar i 15 aa korrelerats till reducerad känslighet för ganciklovir och aciklovir (aa 460, 520, 590-600, 603 och 607) (4,5,10). Alla förändringar ger inte lika hög grad av resistens. Ofta kan man finna ett flertal mutationer i pul97 hos resistenta CMV-isolat. Genom RFLP analys av förändringar i aa 460, 520 och 591-607 kan 90% av ganciklovirresistenta CMV-stammar på grund av pul97 förändringar identifieras (5,10). De mutationer som inducerar ganciklovirresistens och som har påvisats i fler än ett isolat finns listade i Tabell II. CMV DNA polymeras består av 1242 aa, varav totalt 293 aa ingår i någon av de åtta konserverade regioner som finns mellan alla DNA-polymeraser (se Figur 3). De är numrerade i fallande skala från I till VII, där region I är den mest konserverade. Den åttonde regionen A ingår i -region C och finns inte i humant DNA polymeras α. N-terminalen uttrycker 5-3 Exonukleas aktivitet och C-terminalen binder till polymerasassocierade proteinet pul44. Alla åtta regioner ingår i det katalytiska området. Mutationer i 14 aa (408, 412, 413, 501, 513, 522, 545, 781, 802, 809, 812, 981-982, 987) i DNA-polymeras har identifierats att orsaka ganciklovirresistens (Tabell III) (4,5,11,12). Tabell II. Antal publicerade ganciklovirresistenta isolat med mutation i UL97 (5) Mutation M460V M460I H520Q A591V C592G A594V L595F L595S L595 C603W Antal 21 7 6 2 5 24 5 23 2 5 Figur 3. CMV DNA polymerasets funktionella regioner. I nedre delen visas var mutationer i CMV DNA polymeras som inducerar resistens är belägna. Mutationer som inducerar förändrad antiviral känslighet: CMV: GCV och cidofovir * * * * * CMV: foscarnet * * * * * Tabell III. Sammanställning av mutationer i CMV DNA polymeras som inducerar resistens (4, 5,11,12,14) Region Aminosyra Foscarnet Ganciklovir Cidofovir IV 408 R R IV 412 R R IV 413 R R d-region C 501 R R d-region C 513 R R d-region C 522 R R d-region C 545 R R d-region C 588 R II 700 R II 715 R VI 781 R R 802 R R III 809 R R III 812 R R V del 981-982 R R R V 987 R R Info från Läkemedelsverket 7/8:2001 21

Mindre än 5% av ganciklovirresistenta har endast förändrat DNA-polymeras som orsak till resistens (10). Vissa studier har visat att en kombination av förändrat pul97 och DNA-polymeras ger höggradig resistens (13). Det finns även studier som har identifierat höggradigt ganciklovirresistenta isolat med endast förändrat pul97 (4,5). Alla dessa förändringar i DNA-polymeraset förutom tre (aa781, 802 och 809) orsakar korsresistens mot cidofovir (4,5,11,12). Fem av mutationerna (aa781, 802, 809, 822 och 981-982) inducerar också foscarnetresistens (4,5,12,14). En studie har visat att 29% av de 13 patienter som behandlats med cidofovir 3 månader utsöndrade cidofovirresistenta CMV-stammar (ej genotypade) (15). De mutationer i DNA-polymeraset som har identifierats att orsaka cidofovir resistens (aa 408, 412, 413, 501, 513, 522, 545, 812, 981-982, 987) orsakar också ganciklovirresistens (Tabell III). Två av dem (812 och 981-982) inducerar foscarnetresistens. I litteraturen finns beskrivningar av CMV-isolat som endast har 1 gång högre IC 50 värden jämfört med ett känsligt isolat och som definierats som resistenta. Foscarnet är en drog där stora skillnader i känslighet (IC 50 ) för en och samma stam (AD169) analyserad med samma typ av metod (plackreduktionsmetoden) är beskrivna (64-250 µm) (5). Trots detta används värden mellan 300 och 400 µm som definition för foscarnetresistens med plackreduktionsmetoden. Det terapeutiska intervallet för foscarnet är snävt. Intermediära IC 50 värden (300-400 µm) ligger nära toxiska nivåer, vilket gör behandling svårt. Få foscarnetresistenta isolat som är genotypade har beskrivits i litteraturen. Vid en summering av 13 olika studier hade 4% (18/390) IC 50 > 400 µm vilket kan vara ett mått på reducerad känslighet. Dock har en stor studie beskrivit att 9% av CMVisolaten efter tre månaders foscarnetbehandling och 26% efter sex månaders behandling IC 50 > 400 µm (15). Dessa isolat var inte genotypade. Totalt åtta mutationer har identifierat att orsaka foscarnetresistens (588,700,715,781,802,809,812 och D981-982) (4,5,12,14). Fyra av dessa (802,809, 822 och 981-982) orsakar korsresistens för ganciklovir och cidofovir (Tabell III). Mutationen i aa 781 orsakar också ganciklovirresistens. Alla de CMV-isolat som har genotypisk resistens har erhållits från patienter som har behandlats med flera droger och det är därför svårt att identifiera vilka mutationer som har uppstått vid foscarnetbehandlingen (4,5,11,12,14). Vid långtidsodling (>1 år) av en känslig CMV-stam vid närvaro av stigande foscarnetkoncentration i odlingsmediumet har mutationer i DNA-polymeraset inducerats (16). Att inducera mutationer i pul97 med ganciklovir går snabbare (cirka nio månader) (16). Resistens mot fomivirisen har inte påvisats i kliniska isolat. Dock har en resistent CMV-stam selekterats fram vid en in vitro studie (2). Orsaken till den tio gånger lägre känsligheten (IC 50 ) för fomivirsen är okänd, men det berodde inte på mutationer i mål-mrna. Framtida antiviraler Kombinationsbehandling av olika antiviraler är bevisat effektivt för behandling av HIV-infektioner. Nuvarande anti-cmv drogers biverkningsprofiler gör det dock svårt att kombinera dessa effektivt. Bättre antiviraler med högre biotillgänglighet, lägre toxicitet och alternativa verkningsmekanismer behövs. Valganciklovir är en prodrog till ganciklovir med tio gånger bättre oral biotillgänglighet. Den är godkänd av FDA i USA för behandling av CMV-retinit (17). Denna drog har samma antivirala verkningsmekanism och biverkningsprofil som ganciklovir. Adefovir (oral drog) är en nukleotidanalog (fosfometoxyderivat av adenin) som likt cidofovir inte kräver fosforylering av CMV-pUL97 (4). Den njurnedsättande funktionen är dock dosbegränsande för behandling med adefovir. BAY 38-4766 (IV och oral drog) är en icke-nukleosidhämmare. Denna drog blockerar klyvningen av det konkatemeriska CMV DNA och därmed virionpackningen. Drogen har visat sig ha gynnsam farmakologi och biverkningsprofil vid fas I försök (17,18). GEM123 (intravitrialt bruk) är likt fomivirisen en fosforotioat-oligonukleotid (2). Den är en antisensoligonukleotid för splicingregionen av CMV UL36. Blockering av UL36 uttrycket hämmar CMV DNA replikationen. Benzimidazole ribosider är en ny typ av antiviraler med anti-cmv-effekt. L-ribos benzimidazol (GW1263W94, oral drog) hämmar CMV pul97 kinaset vilket inverkar på vriusreplikationen. Vid korttidsbehandling med GW1263W94 har kraftigt reducerad CMV-mängd och få biverkningar påvisats (4,17,18). De två D-ribos benzimidazolerna BDCRB och TCRB påverkar packningen av CMV DNA i virionen. Dessa droger verkar dock ha kort halveringstid (4). Lobucavir är en nukleosid analog (cyklobutylgunaninderivat) som mono-, di- och trifosforyleras av cellulära enzymer. Detta gör att drogen är verksam för CMV-stammar med muterat pul97 (4). Man har dock funnit oncogena effekter vid djurförsök (4). Andra anti-cmv-strategier studeras såsom blockering av CMV-gB processningen och CMV-proteshämmare (2,17,18). 22 Info från Läkemedelsverket 7/8:2001

Referenser 1. Balfour HH. Antiviral drugs. N Eng J Med 1999;340(16):1255-68. 2. Field KA. Human cytomegalovirus: challenges opportunities and new drug development. Antiviral Chem Chemother 1999;10:219-32. 3. Drew WL. Treatment of drug-resistant CMV disease in HIV-infected patients. Infect Med 2000;17(11):737-44. 4. Chou S. Antiviral drug resistance in human cytomegalovirus. Transpl Infect Dis 1999;1:105-14. 5. Erice E. Resistance of human cytomegalovirus to antiviral drugs. Clin Microbiol Rew 1999;12(2): 286-97. 6. Emery VC, Cope AV, Bowen EF, Gor D, Griffiths PD. The dynamics of human cytomegalovirus replication in vivo. J Exp Med 1999;190:177-82. 7. Drew WL, Miner RC, Busch DF et al. Prevalence of resistance in patients receiving ganciclovir for serious cytomegalovirus infection. J Infect Dis 1991;163:716-19. 8. Jabs DA, Enger C, Dunn JP et al. Cytomegalovirus retinitis and viral resistance: ganciclovir resistance. J Infect Dis 1998;177:770-3. 9. Liu W, Shum C, Martin DF et al. Prevalence of antiviral drug resistance in untreated patents with cytomegalovirus retinitis. J Infect Dis 2000; 182(4):1234-8. 10. Chou S, Guentzel S, Michels KR et al. Frequency of UL97 phosphotransferase mutations related to ganciclovir resistance in clinical cytomegalovirus isolates. J Infect Dis 1995; 172:239-42. 11. Chilar T, Fuller MD, Mulato AS et al. A point mutation in the human cytomegalovirus DNA polymerase gene selected in vitro by cidofovir confers a slow replication phenotype in cell culture. Virology 1998;248:382-93. 12. Chou S, Miner RC, Drew WL. A deletion mutation in region V of the cytomegalovirus DNA polymerase sequence confers multidrug resistance. J Infect Dis 2000;182:1765-8. 13. Smith IL, Cherrington JM, Jiles RE et al. Highlevel resistance of cytomegalovirus to ganciclovir is associated with alteration in both the UL97 and DNA polymerase genes. J infect Dis 1997;176:69-77. 14. Mousavi-Jazi M, Schloss L, Drew WL et al. Variations in the cytomegalovirus DNA polymerase and phosphotransferase genes in relation to foscarnet and ganciclovir sensitivity. J Clin Virol 2001;in press. 15. Jabs, DA, Enger C, Forman M, Dunn JP. Incidence of foscarnet resistance and cidofovir resistance in patients treated for cytomegalovirus retinitis. The Cytomegalovirus Retinitis and Viral Resistance Study Group Antimicrob Agents Chemother1998;42(9):2240-4. 16. Mousavi-Jazi M, Schloss L, Wahren B, Brytting M. Point mutations induced by foscarnet (PFA) in the human cytomegalovirus DNA polymerase. Submitted. 17. Naesens L, De ClercQ E. Recent developments in herpesvirus therapy. Herpes 2001;8:12-6. 18. Nichols WG, Boeckh M. Recent advances in the therapy and prevention of cytomegalovirus infektions. J Clin Virol 2000;16:25-40. Laboratoriediagnostik av infektioner med humant cytomegalvirus SIGVARD OLOFSSON Inledning Humant cytomegalvirus (CMV) är den viktigaste orsaken till kongenital infektion hos människa. CMV orsakar sällan sjukdom hos vuxna immunkompetenta individer, men CMV-infektioner hos det ökande antalet patienter med inducerad eller förvärvad immunsuppression utgör ett svårt problem. Behandling av CMV-infektioner hos dessa patienter är inte utan komplikationer, eftersom existerande kemoterapi mot CMV är behäftad med biverkningar. Detta ställer höga krav på en snabb och säker laboratoriediagnostik av CMV-relaterade infektioner. Under den senaste tioårsperioden har molekylärbiologiska metoder, moderna metoder för antigendetektion och serologi kommit att ersätta äldre, långsam metodik, baserad på virusisolering i cellkultur. Avsikten med denna framställning är att ge en översikt över nuvarande tillgänglig metodik för laboratoriediagnostik och illustrera några aspekter av dess användning. Info från Läkemedelsverket 7/8:2001 23

Laboratoriediagnostik, Metoder Isolering av virus Traditionell virusisolering Den traditionella metoden innebär inokulation av provmaterial på in vitro-odlade humana fibroblaster av låg passagenivå. Cytopatogen effekt, specifik för CMV, uppträder dock oftast sent och kulturerna behöver därför observeras så länge som en månad. Vissa typer av prov som innehåller mycket virus kan dock ge upphov till cytopatogen redan efter ett par dagar. Infektiöst CMV är extremt känsligt för fysisk och kemisk påverkan, och provmaterial bör sändas iskylt med (iakttagande av) så kort transporttid som möjligt. Virusisolering är fortfarande en viktig metod i vissa situationer, framförallt för fenotypisk identifiering av behandlingsresistenta virusstammar. (Detta behandlas närmare i Maria Bryttings kapitel Antivirala medel mot CMV, verkningsmekanismer och resistensutveckling ). Shell vial-isolering Denna teknik innebär att virus appliceras på cellytan genom centrifugering under 800-1600 g. Detta förfarande effektiviserar virusupptag i cellerna, och genom att utnyttja antikroppar mot tidiga CMV-antigen som färgreagens kan karaktäristiska inklusioner iakttas i positiva kulturer redan efter 24 timmar (1). Nyligen har en studie i transplantationsmaterial genomförts i vilken shell vial-isolering (inokulation av cellbundet virus från helblod) och kvantitativ serum- PCR (AMPLICOR, se nedan) jämfördes (2-3). Den senare metoden visade sig i båda studierna vara betydlig känsligare. Antigenemidetektion Antigenemidetektion innebär att leukocyter från perifert blod isoleras fixeras på ett objektglas och därefter färgas med en monoklonal antikropp mot ett CMV-antigen, som förekommer i stor mängd i CMV-infekterade celler (till exempel p52 som kodas av UL44 på CMV-genomet) (1). Analysresultat anges som antalet antigenpositiva celler (karaktäristiska intranukleära inklusioner, iakttagbara i låg förstoring) ställt i relation till totala antalet räknade celler. Metoden, som refererats ingående av Hodinka (4), utmärker sig för hög känslighet och god klinisk relevans i många fall. Den handikappas av krav på korta transporttider, tekniskt komplicerad optimering av fixeringsprocessen, samt tidskrävande, mikroskopisk evaluering av resultatet. Antigenemidetektion har jämförts med såväl isoleringsmetoder som PCR och andra amplifieringsmetoder. Till följd av den ovan nämnda optimeringsproblematiken ger dock dessa studier i viss mån divergerande resultat, och läsaren hänvisas till en översikt för en mer ingående diskussion antigenemidetektionens prestanda jämfört med andra metoder (5). Generellt tycks antigenemidetektion ha högre känslighet än odlingsmetoder, medan amplifieringsmetoder har bättre eller likvärdig känslighet jämfört med antigenemidetektion. Molekylärbiologiska metoder Kvalitativ DNA-amplifiering Under de senaste tio åren har kvalitativ polymerase chain reaction (PCR) blivit ett dominerande analysverktyg för CMV-diagnostik. Kunskapen om principerna för PCR är numera så allmänt spridd, att dessa inte behandlas närmare här. Två av de PCR-system som för närvarande används i Sverige etablerades redan under 1990-talets början och har varit i klinisk användning sedan dess (6-7). Bägge dessa system är så kallade nested PCR, det vill säga i ett första amplifieringssteg används ett primerpar, vars produkt utgör mål för ytterligare ett primerpar. Slutprodukten detekteras som ett fluorescerade band med karaktäristisk molekylvikt vid etidiumbromidfärgning/uv-belysning efter elektrofores av produkten i agaros. Nestningsförfarandet innebär dels ökad känslighet, dels att tillräcklig mängd amplifierat material bildas för att möjliggöra detektion. Proceduren kan anpassas att omhänderta samtliga typer av prover, som brukar sändas för virologisk diagnostik, men den är arbetsintensiv och ställer stora krav på operatörens skicklighet framför allt för undvikande av kontamination. Kvalitativ PCR har medfört betydande förbättringar av CMV-diagnostiken avseende såväl förkortade svarstider, ökad känslighet och, för de flesta provmaterial, mindre strikta krav på provets transportbetingelser. Testernas känslighet tangerar 1 fg CMV DNA, vilket motsvarar något tiotal viruspartiklar. Det kan förutses att kvalitativ CMV-PCR går mot en högre grad av automatisering både vad gäller provberedning och detektion av amplifierad produkt. Kvantitativ DNA-amplifiering På grund av att amplifieringseffektiviteten varierar starkt mellan individuella prov föreligger inget enkelt samband med den erhållna PCR-signalens intensitet och den mängd CMV DNA som finns i provet. För närvarande utnyttjas två principer för att utnyttja genom amplifiering för att bestämma mängden CMV DNA i ett prov, (4-5, översiktsartiklar). Den ena principen bygger på att CMV DNA i provet co-amplifieras med en DNA-standard av känd mängd. Både standard och prov amplifieras med samma effektivitet, och därför kan man inom vissa gränser bestämma mängden CMV DNA i provet. COBAS-AMPLICOR (Roche) är exempel på en 24 Info från Läkemedelsverket 7/8:2001

kommersiell produkt, för kvantifiering av CMV DNA baserad på denna princip. Den andra principen är realtids-pcr, som innebär att mängden nybildat DNA mäts direkt i reaktionsblandningen efter varje amplifieringscykel. Denna mätning kan ske via konfirmerande hybridisering enligt två etablerade system (Taq Man, Applied Biosystems; Light Cycler, Roche) eller via ett system för direktmätning av dubbelsträngat DNA (SYBR-Green). Utmärkande för dessa system är att de detekterar så låga koncentrationer av amplifierat DNA att amplifieringseffektiviteten under dessa förhållanden är maximal och konstant. Därigenom blir ordningsnumret på den amplifieringscykel när signal detekteras omvänt proportionell mot logaritmen för den ursprungliga mängden CMV DNA i provet. Det finns för närvarande inga kommersiella analyssystem baserade på realtids- PCR för kvantifiering av CMV DNA, men tekniken är väl lämpad för utveckling av in house system och flera sådana är publicerade (4,8). Den så kallade light up-proben, utgöres av en probe baserad på peptide-nucleic acid (PNA) kopplad till asymmetrisk cyanin-kromofor. Den är ett ytterst känsligt, specifikt och icke-interfererande detektionssystem för PCR-produkter i realtid (9). De stora fördelarna med realtids-pcr för kvantifiering av CMV DNA är hög känslighet, där i princip enstaka genomkopior i provmaterialet kan detekteras, korta svars- och hanteringstider, och ett mycket stort mätintervall omfattande sex log-steg eller mer. Den effektiva känsligheten för kliniska provmaterial blir således avhängig av mängden provmaterial, som kan utnyttjas för extraktion. Den kommersiella PCR-testen, COBAS-AMPLICOR, baserad på co-amplifiering av en internstandard uppvisar en relativt hög känslighet (400 kopior CMV DNA/ml) och god reproducerbarhet men av de ovan nämnda skälen kommer kommersiella eller laboratorieutvecklade realtids-pcr-system sannolikt att bli dominerande för kvantifiering av CMV DNA i kliniska prov. En signalförstärkningsmetod, baserad på komplexbindning av virusgenom med multimerer av förgrenade DNA-molekyler, så kallade Branched DNA (Chiron) har visat sig konkurrenskraftig för detektion och kvantifiering av andra virala agens (5). Det saknas dock publikationer från senare år som dokumenterar metodens värde för CMV-diagnostik. Det finns även andra direktdetektionsmetoder för CMV DNA, varav en del kommersiellt marknadsförda. Dessa har i regel betydligt lägre känslighet än vad som normalt uppnås med amplifieringsmetoder och de behandlas inte närmare här. RNA-amplifiering Cellulär expression av CMV RNA är en tillförlitlig markör för replikerande CMV. Den för närvarande för kliniskt bruk mest utnyttjade metoden är NAS- BA (Organon Teknika). Denna är en primer-baserad specifik amplifieringsmetod, som arbetar vid konstant temperatur och därför inte behöver utnyttja någon thermocycler. Amplifieringen utnyttjar koordinerat tre enzymaktiviteter: AMV reverst transkriptas (RT), T4-fagens RNA polymeras och den med RT associerade RNAse H-aktiviteten. RT-stegets integrering i den cykliska processen gör metoden särskilt anpassad för RNA-analys. Känsligheten hög och metoden har ett mätintervall motsvarande fem log-steg. Metoden har beskrivits ingående i en ett par år gammal översikt (4). Molekylärbiologiska in situ-metoder Vid misstanke om CMV-infektion i solida organ hos immundefekta patienter är det särskilt viktigt att avgöra att virusreplikation faktiskt äger rum i det aktuella organet. I dessa situationer är in situ-hybridisering en värdefull metod. Snittat biopsimaterial inkuberas med en speciellt märkt probe, som är specifik för någon av generna för de tidiga CMV-proteinen. Efter borttvättning av ickebunden probe kan, beroende på metodens design, celler som innehåller CMV-genom eller specifika transkript detekteras via den specifika märkningen. Tidigare versioner av metoden krävde utnyttjande av radioaktiva isotoper och var tekniskt komplicerade. Numera har isotopoberoende tekniker med större tillhänglighet för analys av kliniska material vunnit insteg. Detektion med FITC- eller digoxigenin-märkta prober, där hybridisering visualiseras med HRP-konjugerade antikroppar mot respektive ligand, medför hög specificitet och känslighet. In situ-hybridisering har använts för analys av biopsimaterial från benmärgstransplanterade (10) och hjärttransplanterade patienter (11), samt från obduktionsmaterial efter intrauterin CMV-infektion (12). Värdet av hybridisering jämfört med till exempel immunocytokemisk färgning är inte entydig. Någon kliniskt applicerbar in situ-pcr-metod för CMV tycks för närvarande inte finnas. Serologi IgM-bestämning ELISA-bestämningar av CMV-specifikt IgM är i hög grad beroende av det antigen som använts. Variationer mellan olika batcher av antigen som prepareras från CMV-infekterade celler ger ibland upphov till bristande överensstämmelse mellan olika tester (13). Ett sätt att eliminera detta problem är att basera antigenet på rekombinant producerade CMV-proteiner, vilket medför att standardiserade Info från Läkemedelsverket 7/8:2001 25

analysbetingelser kan uppnås över tid. Det finns nu kommersiella test, som är baserade på denna princip. Av dessa har AxSYM (Abbott) visat sig ha goda egenskaper jämfört med andra test (13). Det bör dock betonas att falskt positiva resultat till följd av serologisk korsreaktivitet mellan herpesgruppens virus kan erhållas även med nyare rekombinant antigenbaserade metoder (14). Indirekt immunofluorscens, baserad på fixerade CMV-plaque utgör en godtagbar in house-assay, vars prestanda i många avseenden är jämförbara med många ELISA-system (15-17). IgG-bestämning IgG-bestämning är viktigt för utredning av immunitet efter genomgången infektion. CMV-infektion kan verifieras genom påvisad IgG-titerstegring mellan akut och konvalesentprov. Värdet av denna analys begränsas av att serokonversion kommer sent och förhållandet att många patientgrupper passivt kan ha erhållit CMV-specifikt IgG genom transfusioner. Påvisande av IgG med låg aviditet mot CMV är en intressant av approach för detektion av primärinfektion (18). De flesta moderna metoder för CMV-IgG har en hög känslighet och specificitet (19), vilket är av vikt till exempel för att säkerställa seronegativitet hos organdonatorer i de fall recipienten är CMV-negativ. Metodologiska aspekter laboratoriediagnostik av CMV-infektioner vid olika tillstånd Nedan ges några exempel på några tillstånd där nyutvecklad metodik för CMV-diagnostik applicerats. Kongenital/neonatal infektion Kvalitativ CMV-PCR av amnionvätska har i de flesta studier lika bra eller bättre sensitivitet än den traditionella virusisoleringen för diagnos av kongenital infektion (20). En kvantitativ studie har rapporterat en korrelation mellan mängden virus-dna i amnionvätska och svårighetsgrad av uppkomna symtom (20). Serodiagnos av kongenital CMV-infektion genom IgM-analys är en snabb metod för diagnos, men den ger i flera studier upphov till falskt negativa resultat och PCR/virusisolering bör göras på misstänkta, IgM-negativa fall (21). Prov för virusisolering måste tas inom två till tre veckor efter partus för att intrauterin infektion skall kunna säkerställas. CNS-infektioner CMV-infektioner i CNS kan förekomma både hos immunkompetenta vuxna och hos barn. Kvalitativ CMV-PCR i likvor rekommenderas som diagnostisk metod. Eftersom CNS-engagemanget hos såväl CMV som andra herpesgruppens virus kan resultera i olika och ibland oväntade symtombilder kan det vara tillrådligt att sända likvorprov för PCR-analys mot herpesgruppens virus även i fall där virusmisstanken inte är stark (22). CMV-infektioner hos transplanterade och andra patientkategorier med nedsatt immunsvar Kolit Tidiga rapporter antyder en viss korrelation mellan positiv CMV-PCR av biopsimaterial och kolit (23), vilket medfört att negativ CMV-PCR i faeces har använts som en icke-invasiv metod att utesluta CMVinducerad tarmsjukdom. Denna strategi är dock förenad med vissa risker eftersom komponenter i faeces kan inhibera så kallad fastfasbaserad DNA-extraktion, och därigenom ge upphov till falskt negativa resultat (24). På grund av den höga känsligheten bör även positiva icke-kvantitativa PCR-resultat från organmaterial tolkas försiktigt. CMV-sjukdom hos transplantationspatienter Trots att CMV replikerar långsamt i cellkultur visar kinetiska analyser att CMV förökas relativt hastigt in vivo, med en fördubblingshastighet på ungefär ett dygn (25). En stor studie visar att kvantitativ PCR av CMV DNA i helblod har ett mycket stort värde när det gäller att prediktera CMV-sjukdom (26), där två parametrar betonas som särskilt viktiga: mängden CMV i första positiva prov och virusförökningshastigheten, som kan kalkyleras efter analys av ett andra prov. Litteraturen ger ingen entydig bild av det prediktiva värdet av antugenemi-bestämningar (pp65) (27-28). Flera studier betonar värdet av CMV-NASBA, eftersom förekomst av mrna kan utgöra en mer direkt och transient markör av replikerande CMV (29). Lokal transient virusreplikation ger dock inte alltid upphov till sjukdom. Våra resultat visar således att höga titrar av CMV DNA i BAL hos lungtransplanterade patienter inte predikterar CMV-sjukdom (30). Ett negativt BAL-resultat har däremot ett högt negativt prediktivt värde. Konklusion Utvecklingen av framför allt realtids-pcr mot snabba, högkänsliga kvantitativa metoder har nu skapat tillförlitliga instrument för detektion och monitorering av CMV DNA hos immunsupprimerade patientgrupper. Existerande sekvenserings och genotypningsrutiner får en tillgänglighet som kan medge en kliniskt användbar monitorering av behandlingsresistenta CMV-varianter. Kombinationen av de molekylärbiologiska metoderna och moderna serologiska tekniker ger ett förbättrat stöd vid frågeställningar som avser kongenitala CMV-infektioner. Kvalitativ PCR i likvor har utvecklats till ett gott verktyg för diagnos av CNS-infektioner av CMV och andra herpesgruppens virus. 26 Info från Läkemedelsverket 7/8:2001

Referenser 1. Gerna G, Revello MG, Percivalle E, Zavattoni M, Parea M et al. Quantification of human cytomegalovirus viremia by using monoclonal antibodies to different viral proteins. J Clin Microbiol 1990;28:2681-8. 2. Aitken C, Barrett-Muir W, Millar C, Templeton K, Thomas J, Sheridan F et al. Use of molecular assays in diagnosis and monitoring of cytomegalovirus disease following renal transplantation. J Clin Microbiol 1999;37:2804-7. 3. Sia IG, Wilson JA, Espy MJ, Paya CV, Smith TF. Evaluation of the COBAS AMPLICOR CMV MONITOR test for detection of viral DNA in specimens taken from patients after liver transplantation. J Clin Microbiol 2000;38:600-6. 4. Hodinka RL. The clinical utility of viral quantitation using molecular methods. Clin Diagn Virol 1998;10:25-47. 5. Boeckh M, Boivin G. Quantitation of cytomegalovirus: methodologic aspects and clinical applications. Clin Microbiol Rev 1998;11:533-54. 6. Studahl M, Ricksten A, Sandberg T, Bergstrom T, Elowson S. Cytomegalovirus encephalitis in four immunocompetent patients [letter]. Lancet [0140-6736] 1992;340:1045-6. 7. Brytting M, Sundqvist VA, Stalhandske P, Linde A, Wahren B. Cytomegalovirus DNA detection of an immediate early protein gene with nested primer oligonucleotides. J Virol Methods 1991;32:127-38. 8. Yun Z, Lewensohn-Fuchs I, Ljungman P, Vahlne A. Real-time monitoring of cytomegalovirus infections after stem cell transplantation using the TaqMan polymerase chain reaction assays. Transplantation 2000;69:1733-6. 9. Svanvik N, Stahlberg A, Sehlstedt U, Sjoback R, Kubista M. Detection of PCR products in real time using light-up probes. Anal Biochem 2000;287:179-82. 10. Kraus MD, Feran-Doza M, Garcia-Moliner ML, Antin J, Odze RD. Cytomegalovirus infection in the colon of bone marrow transplantation patients. Mod Pathol 1998;11:29-36. 11. Muir SW, Murray J, Farquharson MA, Wheatley DJ, McPhaden AR. Detection of cytomegalovirus in upper gastrointestinal biopsies from heart transplant recipients: comparison of light microscopy, immunocytochemistry, in situ hybridisation, and nested PCR. J Clin Pathol 1998;51:807-11. 12. Kasprzak A, Zabel M, Wysocki J, Biczysko W, Surdyk-Zasada J et al. Detection of DNA, mrna and early antigen of the human cytomegalovirus using the immunomax technique in autopsy material of children with intrauterine infection. Virchows Arch 2000;437:482-90. 13. Lazzarotto T, Galli C, Pulvirenti R, Rescaldani R, Vezzo R et al. Evaluation of the Abbott AxSYM Cytomegalovirus (CMV) Immunoglobulin M (IgM) Assay in Conjunction with Other CMV IgM Tests and a CMV IgG Avidity Assay. Clin Diagn Lab Immunol 2001;8:196-8. 14. Deyi YM, Goubau P, Bodeus M. False-positive IgM antibody tests for cytomegalovirus in patients with acute Epstein-Barr virus infection. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 2000;19:557-60. 15. de Ory F, Leon P, Domingo C, Garcia-Saiz A, Perez L et al. Comparison of four methods for screening of cytomegalovirus antibodies in normal donors and immunocompromised patients. Eur J Clin Microbiol 1987;6:402-5. 16. Krishna RV, Meurman OH, Ziegler T, Krech UH. Solid-phase enzyme immunoassay for determination of antibodies to cytomegalovirus. J Clin Microbiol 1980;12:46-51. 17. Pass RF, Griffiths PD, August AM. Antibody response to cytomegalovirus after renal transplantation: comparison of patients with primary and recurrent infections. J Infect Dis 1983;147:40-6. 18. Blackburn NK, Besselaar TG, Schoub BD, O'Connell KF. Differentiation of primary cytomegalovirus infection from reactivation using the urea denaturation test for measuring antibody avidity. J Med Virol 1991;33:6-9. 19. Weber B, Fall EM, Berger A, Doerr HW. Screening of blood donors for human cytomegalovirus (HCMV) IgG antibody with an enzyme immunoassay using recombinant antigens. J Clin Virol 1999;14:173-81. 20. Liesnard C, Donner C, Brancart F, Gosselin F, Delforge ML et al. Prenatal diagnosis of congenital cytomegalovirus infection: prospective study of 237 pregnancies at risk. Obstet Gynecol 2000;95:881-8. 21. Ahlfors K, Ivarsson SA, Harris S. Report on a long-term study of maternal and congenital cytomegalovirus infection in Sweden. Review of prospective studies available in the literature. Scand J Infect Dis 1999;31:443-57. 22. Bergström T, Olofsson S, Studahl M, Kyllerman M, Darin N et al. Gendetektion med PCR vid virala CNS-infektioner ger snabb och specifik diagnostik av herpesgruppens virus. Läkartidningen 1995;92:427-32. 23. Cotte L, Drouet E, Bissuel F, Denoyel GA, Trepo C. Diagnostic value of amplification of human cytomegalovirus DNA from gastrointestinal biopsies from human immunodeficiency Info från Läkemedelsverket 7/8:2001 27

virus-infected patients. J Clin Microbiol 1993;31:2066-9. 24. Boom R, Sol C, Weel J, Lettinga K, Gerrits Y et al. Detection and quantitation of human cytomegalovirus DNA in faeces. J Virol Methods 2000;84:1-14. 25. Emery VC, Griffiths PD. Prediction of cytomegalovirus load and resistance patterns after antiviral chemotherapy. Proc Natl Acad Sci U S A 2000;97:8039-44. 26. Emery VC, Sabin CA, Cope AV, Gor D, Hassan-Walker AF et al. Application of viral-load kinetics to identify patients who develop cytomegalovirus disease after transplantation. Lancet 2000;355:2032-6. 27. Nichols WG, Corey L, Gooley T, Drew WL, Miner R et al. Rising pp65 antigenemia during preemptive anticytomegalovirus therapy after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation: risk factors, correlation with DNA load, and outcomes. Blood 2001;97:867-74. 28. Baldanti F, Revello MG, Percivalle E, Gerna G. Use of the human cytomegalovirus (HCMV) antigenemia assay for diagnosis and monitoring of HCMV infections and detection of antiviral drug resistance in the immunocompromised. J Clin Virol 1998;11:51-60. 29. Gerna G, Baldanti F, Lilleri D, Parea M, Alessandrino E, Pagani A et al. Human cytomegalovirus immediate-early mrna detection by nucleic acid sequence-based amplification as a new parameter for preemptive therapy in bone marrow transplant recipients. J Clin Microbiol 2000;38:1845-53. 30. Riise GC, Andersson R, Bergström T, Lundmark A, Nilsson FN et al. Quantification of cytomegalovirus DNA in BAL fluid : A longitudinal study in lung transplant recipients. Chest 2000; 118:1653-60. CMV-infektioner efter stamcellstransplantation PER LJUNGMAN Bakgrund CMV har varit en av de viktigaste infektionerna efter allogen stamcells- (tidigare benmärgs-) transplantation. Under 1980-talet dog mellan 5-15% av transplanterade patienter i CMV-sjukdom, varav den allvarligaste var pneumonit. Under det senaste decenniet har stora framsteg gjorts, och dödligheten hos så kallade lågriskpatienter har sjunkit till under 1% (1). Under samma tid har dock nya kategorier av patienter blivit aktuella för stamcellstransplantation, och nya metoder, framför allt användning av alternativa donatorer (mismatchade familjemedlemmar eller obesläktade frivilliga), har introducerats. Dessa patienter har ökad risk för CMV-sjukdom och dödligheten i CMV-sjukdom (hos dessa patienter) är fortfarande upp emot 10%. Därutöver diskuteras för närvarande CMV indirekta effekt hos transplantationspatienter, till exempel immunosuppressiva effekter med ökade risker för andra infektioner som följd. Det är därför nödvändigt att alla centra som utför allogen stamcellstransplantation har en genomtänkt strategi för handhavande av CMV-infektioner. Denna strategi måste inkludera förebyggande av primärinfektion, åtgärder för att förebygga CMVsjukdom hos redan CMV-seropositiva patienter, samt behandling av etablerad CMV-sjukdom. Förebyggande av primära infektioner Det är viktigt att på ett tidigt stadium fastställa serologiskt status hos patienter som kan bli aktuella för stamcellstransplantation. För seronegativa patienter som skall genomgå allogen stamcellstransplantation är det angeläget att i möjligaste mån välja en seronegativ donator, och dessa bör också få antingen blodprodukter från seronegativa blodgivare eller blodprodukter som filtrerats med syfte att reducera antalet leukocyter i produkterna. Tekniken är sannolikt jämförbara när det gäller att reducera risken för överföring av CMV via blodprodukter (2). Immunglobulin har ingen påvisad skyddande effekt mot primärinfektion och är inte indicerat (3-4). Det föreligger inga data från studier där antivirala medel använts som profylax mot primärinfektion. Förebyggande av CMV-sjukdom CMV-sjukdom kan uppstå på grund av primärinfektion eller reaktiverad infektion hos tidigare seropositiva patienter. De strategier som är tänkbara är generell profylax eller så kallad preemptiv behandling av påvisad CMV-infektion. Generell profylax Det första medel som studerades som profylax mot CMV-infektion var intravenöst immunglobulin givet i höga doser. Ett större antal studier genomfördes med olika preparationer och olika design vilket för- 28 Info från Läkemedelsverket 7/8:2001

svårar tolkningen av resultaten. En metaanalys visade dock en minskad risk för CMV-sjukdom hos de patienter som behandlats med immunglobulin (5). Denna analys visade också att så kallad hyperimmunglobulin med höga antikroppshalter mot CMV inte hade bättre effekt än konventionellt immunglobulin. Dessa studier genomfördes innan dagens diagnostiska tekniker fanns, och innan effektiva antivirala medel rutinmässigt användes för profylax eller behandling av dokumenterad CMV-infektion. Inga jämförande studier har gjorts mellan immunglobulin och andra, nyare strategier hos stamcellstransplantationspatienter. De slutsatser som kan dras från icke kontrollerade studier är dock att det idag finns effektivare medel för att förebygga CMV-sjukdom än immunglobulin. Immunglobulin är dessutom väsentligt dyrare än alternativen, och därmed har immunglobulin idag ingen plats som CMV-profylax efter stamcellstransplantation. Aciklovir har en begränsad effekt mot CMV in vitro. Höga koncentrationer ger dock hämning. Två stora kontrollerade studier har genomförts där aciklovir i hög dos (500 mg/m2 x 3) givits intravenöst, följt av höga perorala doser (800 mg x 4). Meyers och medarbetare jämförde hög dos aciklovir med ingen behandling (6) medan Prentice och medarbetare jämförde hög- och normaldos samt kort och långtidsbehandling (7). Bägge studierna visade att patienter behandlade med höga doser av aciklovir hade en lägre risk för CMV-infektion och viremi än de patienter som fick låga doser eller inget aciklovir. Överlevnaden var också högre hos de högdos aciklovirbehandlade patienter i bägge studierna. Valaciklovir är en prodrog till aciklovir som ger högre serumkoncentrationer vid peroral behandling. En stor randomiserad studie inkluderande cirka 750 patienter har nyligen genomförts. Studien har ännu ej publicerats men har presenterats i abstractform. Hög dos aciklovir med hög dos valaciklovir jämfördes (8). Valaciklovir minskade risken för CMV-infektion och viremi samt behovet av preemtiv behandling med andra antivirala medel. Risken för CMV-sjukdom och överlevnaden var dock desamma i bägge studiearmarna. Ganciklovir är effektivt mot CMV in vitro. Två placebokontrollerade, randomiserade studier av ganciklovirprofylax har genomförts (9-10). Ganciklovir är dock benmärgstoxiskt vilket innebär att profylaxen inte kan inledas innan patienterna fått ett stabilt benmärgsanslag vanligtvis innebärande tre till fyra veckor efter transplantationen. Bägge studierna visade att ganciklovir sett i stort helt kunde förhindra CMV-sjukdom under den tid som profylaxen gavs. Ganciklovir gav dock inte någon överlevnadsfördel gentemot placebo. De huvudsakliga skälen till detta var en ökad risk för neutropeniassocierade bakterieeller svampinfektioner, och en ökad risk för CMVsjukdom efter det att profylaxen avslutades. Foscarnet har inte studerats i kontrollerade studier och det är därför svårt att dra några slutsatser om dess effektivitet (11-12). Fördelen med foscarnet jämfört med ganciklovir är att det kan användas även under granulocytopen fas. Foscarnet är dock njurtoxiskt vilket kan innebära problem vid samtidig behandling med andra njurtoxiska droger som cyklosporin A och amfotericin B (12). Preemptiv behandling Definitionen av preemtiv behandling är att en antiviral drog sätts in vid första tecken på CMV-infektion, men innan sjukdom uppkommit. Strategin baserades ursprungligen på att CMV påvisning i blod var starkt prediktivt för uppkomsten av CMV-sjukdom (13). Goodrich och medarbetare jämförde ganciklovirbehandling med placebo i en studie där CMV påvisat med så kallad snabbisolering användes som startpunkt för behandling (14). Studien visade att preemtiv behandling kunde minska risken för CMV-sjukdom och förbättra överlevnaden. Emellertid utvecklade 12% av patienterna CMVsjukdom innan antiviral behandling kunde inledas vilket visade på behovet av tekniker som upptäcker CMV-infektion tidigare än snabbisolering. Under 1990-talet har nya och känsligare diagnostiska tekniker utvecklats framför allt den så kallade antigenemi testen samt tester baserade på nukleinsyraamplifiering exempelvis polymerase chain reaction (PCR) (var god se kapitlet om diagnostik), dessa tillåter snabbare diagnostik av CMV-infektion. Boeckh och medarbetare jämförde i en randomiserad studie antigenemibaserad ganciklovirbehandling med ganciklovir givet som profylax (15). Ganciklovirprofylax var effektivare fram till dag 100 efter transplantationen men vid dag 180 var resultaten av de två strategierna lika. I denna studie användes en något okänslig variant av antigenemitest. I en icke kontrollerad uppföljningsstudie, i vilken man använde en känsligare variant kunde man reducera risken för CMVsjukdom under de första 100 dagarna till nivåer jämförbara med vid ganciklovirprofylax (16). Nukleinsyraamplifiering för påvisande av CMV DNA är en mycket känslig teknik. Känsligheten är bland annat beroende på vilket ursprungsmaterial som används i testerna. PCR-metoder utfört på plasma har jämförbar känslighet med antigenemitest, medan nukleinsyraamplifiering på helblod eller leukocyter är känsligare (17). Detta innebär att diagnosen kan ställas ännu tidigare med nukleinsyraamplifiering än med antigenemi. Einsele och medarbetare Info från Läkemedelsverket 7/8:2001 29

jämförde i en randomiserad studie leukocytbaserad PCR med snabbisolering (18). Patienter som följdes med PCR-diagnostik löpte mindre risk att utveckla CMV-sjukdom och hade bättre överlevnad än patienter som följdes med snabbisolering. Ljungman och medarbetare visade med multivariatanalys att PCR-baserad preemtiv behandling minskade risken för CMV-sjukdom, minskade dödligheten i CMVsjukdom, samt minskade risken för transplantationsrelaterad dödlighet (1). Under de senaste åren har flera studier påvisat betydelsen av virusmängd mätt med kvantitativ PCR för att bättre anpassa preemtiv behandling (19-20). Denna teknik håller idag på att införas i rutinen vid många centra, men formella utvärderingar saknas ännu. Såväl ganciklovir som foscarnet kan användas för preemtiv behandling. Två randomiserade studier har genomförts. Moretti och medarbetare genomförde en liten pilotstudie som visade jämförbara resultat mellan läkemedlen (21). Reusser och medarbetare utförde en större studie som dock ännu ej är publicerad. Även denna studie visade jämförbar risk för utveckling av CMV-sjukdom och överlevnad mellan grupperna som fått ganciklovir och foscarnet (22). Ganciklovir gav dock en ökad frekvens av granulocytopeni medan risken för njurpåverkan var lika. Behandlingstiderna har varierat mellan olika studier. I USA har man ofta behandlat under åtta till tio veckor (14-15) medan i Europa behandlingstiderna varit mellan två till fyra veckor (18,22-23). Längre behandlingstid ökar sannolikt risken för sen CMVsjukdom på grund av utebliven utveckling av CMVspecifik T-cellsimmunitet (24). Behandling av CMV-sjukdom Det finns inga kontrollerade studier av behandling av CMV-sjukdom. Fram till slutet av 1980-talet var dödligheten i CMV-pneumonit mer än 90%. Tre samtidigt publicerade okontrollerade studier visade att kombinationen av ganciklovir och höga doser av intravenöst givet immunglobulin reducerade den akuta dödligheten till cirka 50% (25-27). Denna kombination har sedan blivit accepterad som standardbehandling, trots att dokumentation av immunglobulinets värde saknas. Värdet av immunglobulintillägget har nyligen ifrågasatts (28). Dödligheten i CMV-sjukdom har under dessa drygt tio år förblivit väsentligen oförändrat hög trots given antiviral behandling. Ljungman och medarbetare visade nyligen i en okontrollerad studie att cidofovir kan vara effektiv behandling för patienter med CMV-pneumonit som progredierar trots standardbehandling (29). Ett annat alternativ kan vara kombinationsbehandling med ganciklovir och foscarnet (30). Vid behandling av andra typer av CMV-sjukdom än pneumonit, som till exempel gastroenterit, talar existerande data för att tillägg av immunglobulin till antiviral behandling inte förbättrar behandlingsresultatet, även om kontrollerade studier saknas (31). CMV-infektion och sjukdom hos autologt stamcellstransplanterade patienter CMV är ett väsentligt mindre problem efter autolog än efter allogen stamcellstransplantation men kan dock orsaka såväl morbiditet som mortalitet till exempel i CMV-pneumoni (32-33). De studier som har utförts har inte kunnat påvisa någon positiv effekt av profylax eller behandling med antivirala medel (34-35). Det kan dock finnas subgrupper av patienter där riskerna för svår CMV-sjukdom är högre, och där intervention med antivirala medel skulle kunna ha bättre effekt (36). Detta behöver dock studeras ytterligare. Andra aspekter Tidigare utvecklades CMV-sjukdom vanligen under de första tre månaderna efter stamcellstransplantation (37). Under det senaste decenniet har CMVsjukdom uppträtt allt senare efter transplantationen. Därtill har nya former av CMV-sjukdom såsom retinit börjat uppträda hos stamcellstransplantationspatienter. Den mest betydelsefulla faktorn för utveckling av sen CMV-sjukdom är oförmåga att utveckla ett specifikt immunsvar mot CMV (38). Ganciklovirbehandling framför allt om det ges som profylax eller längre tids preemtiv behandling kan fördröja utvecklingen av ett CMV-specifikt immunsvar (24). Nya strategier såsom infusion av CMV specifika cytotoxiska lymfocyter är under utveckling men är för närvarande mycket arbetskrävande (39). Ruta 1: Strategier hos stamcellstransplanterade patienter Undvika primärinfektion Val av donator Val av blodprodukter Allmän profylax Riktad profylax (högrisk patienter) Preemtiv terapi Behandling av etablerad sjukdom Ruta 2: Preemtiv behandling Definition: Behandling insätts vid första tecken på CMV-infektion Viktiga frågor: Vilken diagnostisk teknik skall användas? Vilken drog skall användas? Hur länge skall behandling ges? 30 Info från Läkemedelsverket 7/8:2001

Referenser 1. Ljungman P, Aschan J, Lewensohn-Fuchs I, Carlens S, Larsson K, Lönnqvist B et al. Results of different strategies for reducing cytomegalovirus-associated mortality in allogeneic stem cell transplant recipients. Transplantation 1998; 66(10):1330-4. 2. Bowden R, Cays M, Schoch G, Sayers M, Slichter S, Welk K et al. Comparison of filtered blood (FB) to seronegative blood products (SB) for prevention of cytomegalovirus (CMV) infection after marrow transplant. Blood 1995; 86:3598-603. 3. Bowden RA, Fisher LD, Rogers K, Cays M, Meyers JD. Cytomegalovirus (CMV)-specific intravenous immunoglobulin for the prevention of primary CMV infection and disease after marrow transplant. J Infect Dis 1991;164(3): 483-7. 4. Ruutu T, Ljungman P, Brinch L, Lenhoff S, Lönnqvist B, Ringden O et al. No prevention of cytomegalovirus infection by anti-cytomegalovirus hyperimmune globulin in seronegative bone marrow transplant recipients. The Nordic BMT Group. Bone Marrow Transplantation 1997; 19(3):233-6. 5. Bass E, Powe N, Goodman S, Graziano S, Griffiths R, Kickler T et al. Efficacy of immune globulin in preventing complications of bone marrow transplantation: a meta-analysis. Bone Marrow Transplant 1993;12:179-83. 6. Meyers JD, Reed EC, Shepp DH, Thornquist M, Dandliker PS, Vicary CA et al. Acyclovir for prevention of cytomegalovirus infection and disease after allogeneic marrow transplantation. N Engl J Med 1988;318(2):70-5. 7. Prentice HG, Gluckman E, Powles RL, Ljungman P, Milpied N, Fernandez Ranada JM et al. Impact of long-term acyclovir on cytomegalovirus infection and survival after allogeneic bone marrow transplantation. European Acyclovir for CMV Prophylaxis Study Group. Lancet 1994;343(8900):749-53. 8. Ljungman P, De la Camara R, Milpied N, Volin L, Reilly L, Crisp A. A randomized study of valaciclovir as prophylaxis against CMV infection and disease in BMT recipients. Bone Marrow Transplant 1998;23; suppl.1:80. 9. Goodrich JM, Bowden RA, Fisher L, Keller C, Schoch G, Meyers JD. Ganciclovir prophylaxis to prevent cytomegalovirus disease after allogeneic marrow transplant. Ann Intern Med 1993; 118(3):173-8. 10. Winston DJ, Ho WG, Bartoni K, Du Mond C, Ebeling DF, Buhles WC et al. Ganciclovir prophylaxis of cytomegalovirus infection and disease in allogeneic bone marrow transplant recipients. Results of a placebo-controlled, double-blind trial. Ann Intern Med 1993;118(3):179-84. 11. Bacigalupo A, Tedone E, Van Lint MT, Trespi G, Lönngren M, Sanna MA et al. CMV prophylaxis with foscarnet in allogeneic bone marrow transplant recipients at high risk of developing CMV infections. Bone Marrow Transplant 1994;13(6):783-8. 12. Reusser P, Gambertoglio JG, Lilleby K, Meyers JD. Phase I-II trial of foscarnet for prevention of cytomegalovirus infection in autologous and allogeneic marrow transplant recipients [see comments]. J Infect Dis 1992;166(3):473-9. 13. Meyers JD, Ljungman P, Fisher LD. Cytomegalovirus excretion as a predictor of cytomegalovirus disease after marrow transplantation: importance of cytomegalovirus viremia. J Infect Dis 1990;162(2):373-80. 14. Goodrich JM, Mori M, Gleaves CA, Du Mond C, Cays M, Ebeling DF et al. Early treatment with ganciclovir to prevent cytomegalovirus disease after allogeneic bone marrow transplantation. N Engl J Med 1991;325(23):1601-7. 15. Boeckh M, Gooley TA, Myerson D, Cunningham T, Schoch G, Bowden RA. Cytomegalovirus pp65 antigenemia-guided early treatment with ganciclovir versus ganciclovir at engraftment after allogeneic marrow transplantation: a randomized double-blind study. Blood 1996;88(10):4063-71. 16. Boeckh M, Bowden RA, Gooley T, Myerson D, Corey L. Successful modification of a pp65 antigenemia-based early treatment strategy for prevention of cytomegalovirus disease in allogeneic marrow transplant recipients [letter]. Blood 1999;93(5):1781-2. 17. Boeckh M, Gallez-Hawkins G, Myerson D, Zaia J, Bowden R. Plasma polymerase chain reaction for cytomegalovirus DNA after allogeneic marrow transplantation: comparison with polymerase chain reaction using peripherasl blood leukocytes, pp65 antigenemia, and viral culture. Transplantation 1997;64:108-13. 18. Einsele H, Ehninger G, Hebart H, Wittkowski KM, Schuler U, Jahn G et al. Polymerase chain reaction monitoring reduces the incidence of cytomegalovirus disease and the duration and side effects of antiviral therapy after bone marrow transplantation. Blood 1995;86(7):2815-20. 19. Emery VC, Sabin CA, Cope AV, Gor D, Hassan-Walker AF, Griffiths PD. Application of viral-load kinetics to identify patients who develop cytomegalovirus disease after transplantation. Lancet 2000;355(9220):2032-6. Info från Läkemedelsverket 7/8:2001 31

20. Gor D, Sabin C, Prentice HG, Vyas N, Man S, Griffiths PD. Longitudinal fluctuations in cytomegalovirus load in bone marrow transplant patients: relationship between peak virus load, donor/recipient serostatus acute GVHD and CMV disease. Bone Marrow Transplantation 1998; 21(6):597-605. 21. Moretti S, Zikos P, Van Lint MT, Tedone E, Occhini D, Gualandi F et al. Foscarnet vs ganciclovir for cytomegalovirus (CMV) antigenemia after allogeneic hemopoietic stem cell transplantation (HSCT): a randomised study. Bone Marrow Transplantation 1998;22(2):175-80. 22. Reusser P, Einsele H, Lee J, Volin L, Rovira M, Engelhard D et al. Randomized, multicenter, open-label trial of foscarnet versus ganciclovir for preemptive therapy of cytomegalovirus infection after allogeneic stem cell transplantation. In: ICAAC; 1999; San Francisco;1999.p.(abstract). 23. Ljungman P, Lore K, Aschan J, Klaesson S, Lewensohn-Fuchs I, Lönnqvist B et al. Use of a semi-quantitative PCR for cytomegalovirus DNA as a basis for preemptive antiviral therapy in allogeneic bone marrow transplant patients. Bone Marrow Transplant 1996;17(4):583-7. 24. Li CR, Greenberg PD, Gilbert MJ, Goodrich JM, Riddell SR. Recovery of HLA-restricted cytomegalovirus (CMV)-specific T-cell responses after allogeneic bone marrow transplant: correlation with CMV disease and effect of ganciclovir prophylaxis. Blood 1994;83(7):1971-9. 25. Emanuel D, Cunningham I, Jules EK, Brochstein JA, Kernan NA, Laver J et al. Cytomegalovirus pneumonia after bone marrow transplantation successfully treated with the combination of ganciclovir and high-dose intravenous immune globulin. Ann Intern Med 1988;109(10):777-82. 26. Reed EC, Bowden RA, Dandliker PS, Lilleby KE, Meyers JD. Treatment of cytomegalovirus pneumonia with ganciclovir and intravenous cytomegalovirus immunoglobulin in patients with bone marrow transplants. Ann Intern Med 1988;109(10):783-8. 27. Schmidt GM, Kovacs A, Zaia JA, Horak DA, Blume KG, Nademanee AP et al. Ganciclovir/immunoglobulin combination therapy for the treatment of human cytomegalovirus-associated interstitial pneumonia in bone marrow allograft recipients. Transplantation 1988;46(6):905-7. 28. Machado CM, Dulley FL, Boas LS, Castelli JB, Macedo MC, Silva RL et al. CMV pneumonia in allogeneic BMT recipients undergoing early treatment of preemptive ganciclovir therapy. Bone Marrow Transplant 2000;26(4):413-7. 29. Ljungman P, Lambertenghi Deliliers G, Platzbecker U, Matthes-Martin S, Bacigalupo A, Einsele H et al. Cidofovir for of CMV infection and disease in allogeneic stem cell transplant patients. Blood 2001;97(388-392). 30. Bacigalupo A, Bregante S, Tedone E, Isaza A, Van Lint MT, Trespi G et al. Combined foscarnetganciclovir treatment for cytomegalovirus infections after allogeneic hemopoietic stem cell transplantation. Transplantation 1996;62(3):376-80. 31. Ljungman P, Cordonnier C, Einsele H, Bender- Gotze C, Bosi A, Dekker A et al. Use of intravenous immune globulin in addition to antiviral therapy in the treatment of CMV gastrointestinal disease in allogeneic bone marrow transplant patients: a report from the European Group for Blood and Marrow Transplantation (EBMT). Infectious Diseases Working Party of the EBMT. Bone Marrow Transplant 1998;21(5):473-6. 32. Ljungman P, Biron P, Bosi A, Cahn J-Y, Goldstone A-, Gorin N-C et al. Cytomegalovirus interstitial pneumonia in autologous bone marrow transplant recipients. Bone Marrow Transplant 1994;13:209-12. 33. Reusser P, Fisher LD, Buckner CD, Thomas ED, Meyers JD. Cytomegalovirus infection after autologous bone marrow transplantation: occurrence of cytomegalovirus disease and effect on engraftment. Blood 1990;75(9):1888-94. 34. Boeckh M, Gooley TA, Reusser P, Buckner CD, Bowden RA. Failure of high-dose acyclovir to prevent cytomegalovirus disease after autologous marrow transplantation. J Infect Dis 1995; 172(4): 939-43. 35. Boeckh M, Stevens AT, Bowden RA. Cytomegalovirus pp65 antigenemia after autologous marrow and peripheral blood stem cell transplantation. J Infect Dis 1996;174(5):907-12. 36. Holmberg LA, Boeckh M, Hooper H, Leisenring W, Rowley S, Heimfeld S et al. Increased incidence of cytomegalovirus disease after autologous CD34-selected peripheral blood stem cell transplantation. Blood 1999;94(12):4029-35. 37. Meyers JD, Flournoy N, Thomas ED. Risk factors for cytomegalovirus infection after human marrow transplantation. Journal of Infectious Diseases 1986;153(3):478-8. 38. Reusser P, Riddell SR, Meyers JD, Greenberg PD. Cytotoxic T-lymphocyte response to cytomegalovirus after human allogeneic bone marrow transplantation: pattern of recovery and correlation with cytomegalovirus infection and disease. Blood 1991;78(5):1373-80. 39. Walter EA, Bowden RA. Infection in the bone marrow transplant recipient. Infect Dis Clin North Am 1995;9(4):823-47. 32 Info från Läkemedelsverket 7/8:2001

Behandling och profylax av cytomegalvirusinfektioner vid transplantation av solida organ BRITT-MARIE ERIKSSON Behandling Alltsedan man började transplantera solida organ på 1950-talet har cytomegalvirus (CMV)-infektion utgjort ett stort problem. Sjukdomsmanifestationerna sträcker sig från CMV-syndrom; ett tillstånd med feber, myalgi, artralgi, leukopeni och/eller trombocytopeni till svår organinvasiv sjukdom som hepatit, gastroenterit, pneumonit eller retinit. Störst risk att drabbas av svår CMV-sjukdom löper lungtransplanterade. Risken är minst för njurtransplanterade. Risken ökar emellertid i alla grupper vid CMV-mismatch (en seronegativ mottagare får organ från en seropositiv donator, R-/D+) eller om mottagaren behandlas med lymfocytantikroppar. Förutom direkta effekter av CMV-infektion har man observerat indirekta effekter såsom ökad frekvens bakterie- och svampinfektioner, ökad frekvens akuta rejektioner och ökad mortalitet. Belägg finns för att CMV kan bidra till utveckling av ateroskleros i transplantat. Genom behandling med antivirala medel som blev tillgängliga på 1980-talet har komplikationer och mortalitet avsevärt reducerats. Det ansågs redan på ett tidigt stadium att placebokontrollerade studier inte var etiskt försvarbara och kunskapen om behandling av CMV-infektion bygger på kliniska iakttagelser och på ett flertal okontrollerade studier. Förstahandsmedlet för behandling av CMV-sjukdom är ganciklovir. Vanlig behandlingsdos har varit 5 mg/kg x 2 i.v. i två till tre veckor. Efter behandling ses recurrenser hos 6-50%. I ett material om 619 njur- och njur-pankreastransplanterade utvecklade 18,4% CMV-sjukdom. Alla behandlades med GCV i.v. i två till tre veckor. 28/114 (28,6%) fick recurrent sjukdom (1). Av 36 njur- eller levertransplanterade patienter med GCV-behandling fick 31% recurrens (2). Förekomst av CMV DNA i blod förutsade ej recurrens. Däremot fungerade kvantitativ antigenemi som prognostisk markör. Kvantitativ DNA-bestämning i blod har senare också visats vara användbar. Risken för relapse är stor om patienten vid behandlingens utsättande har mer än 1 000-4 000 CMV DNA-kopior per ml blod (3). Tillgång till sådana nya virologiska metoder kommer säkert göra att behandlingsregimerna i framtiden kan individualiseras avsevärt. Som andrahandsmedel till exempel vid terapisvikt eller toxicitet används foscarnet (Foscavir ) i dosen 60 mg/kg x 3 i.v. Detta preparat är väl prövat för behandling av CMV-retinit hos AIDS-patienter men studier gjorda på organtransplanterade är få. En okontrollerad studie av njurtransplanterade visade viss effekt (4). Försiktighet med doseringen måste iakttas hos patienter med nedsatt njurfunktion. Det finns inga studier som visar att oralt ganciklovir, alternativt oralt eller intravenöst aciklovir kan användas för terapi, och teoretiska överväganden gör att man i dag inte rekommenderar detta. Det saknas studier av organtransplanterade, som visar att tillägg av IVIG eller CMVIG till annan antiviral terapi ger ökad effekt. Vid svåra organinvasiva CMV-infektioner kan man dock överväga behandling med immunglobulin även i denna patientgrupp. Cidofovir, som visats effektivt vid behandling av CMV-infektion hos HIV-patienter, har ej systematiskt prövats vid SOT. Dess njurtoxiska bieffekter gör det dock mindre lämpligt vid behandling av njurtransplanterade eller till patienter som behandlas med njurtoxiska medel som cyklosporin eller tacrolimus. Profylax och preemtiv terapi Profylax innebär att alla patienter ges läkemedel för att förebygga infektion eller symtom. Preemtiv terapi bygger på att man regelbundet tar laboratorieprover för att påvisa infektion, exempelvis CMV pp65 antigen eller CMV DNA i blod. Vid positivt test insätts behandling. Man har kunnat visa att avgörande för risken att utveckla symtomgivande infektion är mängden virus i blod. Andra variabler som mismatchning och immunsuppressiv terapi är av underordnad betydelse, även om de ofta korrelerar (5). Profylax är lämpligt att ge då man vet att ett stort antal individer inom en subgrupp kommer att utveckla sjukdom exempel seronegativa mottagare av seropositiva organ (D+/R-). Så kallad riktad profylax kan ges till undergrupper av patienter som löper hög risk att utveckla CMV-sjukdom vid speciella förutsättningar, exempelvis seropositiva recipienter som får tung rejektionsbehandling med antilymfocytglobulin eller OKT-3. Hos subgrupper av patienter med hög virusmängd och stor risk att utveckla CMV-sjukdom kan suboptimal profylaktisk terapi under längre tid leda till utveckling av terapiresistenta stammar. Detta har till exempel iakttagits vid profylax med oralt ganciklovir till CMV mis-matchade pankreasrecipienter (6). Till profylax kan man också räkna åtgärden att endast ge seronegativa eller filtrerade blodprodukter till transplanterade patienter. Info från Läkemedelsverket 7/8:2001 33

Profylax Njure Incidensen av symtomgivande CMV-infektion hos njurtransplanterade är utan preventiva åtgärder omkring 10-30%. Hos D+/R- blir incidensen av CMVsjukdom så hög som 50-100%. Att incidensen varierar i olika studier beror på olika faktorer som andel seronegativa recipienter, nekrodonatorer, retransplanterade, immunosuppressiv terapi, definition av CMV-sjukdom och de virologiska metoder som använts för diagnostik. Redan 1989 visades i en placebokontrollerad, dubbel-blindstudie att profylax med aciklovir 800 mg x 4 i tre månader post-transplantation signifikant sänkte insjuknandet i CMV-sjukdom inom tre månader, från 29% i kontrollgruppen till 7,5% i behandlingsgruppen (7). Största effekten sågs i D+/Rgruppen. I en stor likaledes placebokontrollerad, dubbel-blindstudie av 616 patienter publicerad 1999 visades att valaciklovir i dosen 2 g x 4 i tre månader minskade incidensen CMV-sjukdom inom tre månader från 45 till 3% hos D+/R- patienter och från 6 till 0% hos R+-patienter (8). Vid en längre observationstid insjuknade dock ytterligare patienter och andelen med CMV-sjukdom inom sex månader för D+/R- blev 45% i kontrollgruppen mot 16% i valaciklovirgruppen. Symtomen var lindriga och ingen avled i CMV-sjukdom. Som positiva sidoeffekter sågs en minskad frekvens av akut rejektion samt minskad frekvens av Herpes Simplex- och candidainfektioner. Som negativ sidoeffekt sågs neurotoxiska biverkningar med hallucinationer hos 5% i valaciklovirgruppen. I en annan studie visades att oralt GCV 3 g/dag var mer effektivt än oralt högdos ACV i tre månader. I båda grupperna fick dessutom D+/R-patienter CMVIG i fyra månader (9). Två öppna studier visade en minskad incidens CMV-sjukdom om i.v. GCV 2,5 mg/kg x 2 gavs i samband med antilymfocytglobulinterapi (10-11). I en öppen randomiserad studie visades en lägre frekvens av CMV-sjukdom hos D+/R- patienter som fått oralt GCV i tre månader jämfört med dem som fått i.v. GCV bara under rejektionsbehandling, 29% vs 60% p mindre än 0,05 (12). I en retrospektiv studie där alla recipienter fått högdos ACV oralt i tre månader efter transplantation, och i.v. GCV i samband med antilymfocytglobulinterapi, noterades CMV-sjukdom hos 6/109 (13). Njure-pankreastransplantation Recipienter av njure- och pankreas löper högre risk att utveckla CMV-sjukdom än de som får enbart njure. Inga kontrollerade studier finns. De behöver sannolikt tuffare prevention än de som får enbart njurtransplantat. Levertransplantation Omkring 20-30% av levertransplanterade utvecklar CMV-sjukdom. En prospektiv, randomiserad dubbelblindstudie av 304 patienter visade att oralt ganciklovir 3 g per dag i tre månader förebygger CMVsjukdom. Incidensen CMV-sjukdom vid sex månader var 4,8% i behandlingsgruppen jämfört med 18,9% i placebogruppen (p<0,001) (14). Bland D+/R- patienter var incidensen 14,8 vs 44% (p=0,02), bland patienter som fick antithymocytglobulin (ATG) 4,6% vs 32,9% (p=0,002). I en annan prospektiv, randomiserad dubbelblindstudie av 55 levertransplanterade patienter visades högdos aciklovir i tre månader signifikant förebygga eller fördröja CMV-sjukdom jämfört med placebo (HR 0,31; 95% CI=0,13, 0,78;p=0,013) (15). I en randomiserad, öppen studie har visats att profylax med i.v. ganciklovir är mer effektivt än i.v. aciklovir följt av högdos oralt aciklovir i tre månader (16). Incidensen CMV-sjukdom var 1% med GCV vs 10% med ACV (p<0,05). I två andra randomiserade, öppna studier visades att två veckors i.v. GCV följt av högdos oralt ACV i tre månader var mer effektivt än enbart oralt aciklovir; CMV-sjukdom uppkom i 11% vs 23% (17) och 9% vs 28% (18). En randomiserad, placebokontrollerad, dubbelblindstudie finns med CMVIG-profylax till levertransplanterade (19). Man såg en viss reduktion av svår CMV-sjukdom i behandlingsgruppen men det gällde märkligt nog inte D+/R-. Flera mindre, randomiserade öppna studier med CMVIG eller IVIG som profylax vid SOT har givit divergerande resultat. Hjärttransplantation Incidensen CMV-sjukdom hos hjärttransplanterade är omkring 50-75% för D+/R-, 10-15% för R+, 25% för R+ med antilymfocytglobulin som induktionsterapi och 50-75% för R+ med antilymfocytglobulin som rejektionsterapi (20). Mest effektivt som profylax har i.v. GCV under tre månader visats vara för såväl seronegativa som seropositiva recipienter. Denna behandling kräver emellertid att patienten har en central venväg och daglig sjukvårdskontakt. Ett något mindre effektivt alternativ är GCV i.v. under en till två veckor följt av oralt GCV i tre månader. Ett alternativ för seropositiva recipienter är att ge GCV i.v. då antilymfocytglobulinterapi ges följt av oralt GCV i tre månader alternativt preemtiv terapi. Hjärta-lung- och lungtransplanterade Denna grupp har en mycket hög incidens av CMVsjukdom och är fortfarande mycket problematisk ur CMV-synpunkt. Här tillämpas ofta selektion av or- 34 Info från Läkemedelsverket 7/8:2001

gandonatorer så att inga seronegativa recipienter får organ från seropositiva givare. Få kontrollerade studier finns. I en öppen studie med GCV 5 mg/kg i.v. till alla de första veckorna, och därefter GCV i.v. fem dagar per vecka till ena gruppen och oralt ACV 3,2 g/dag till den andra gruppen i 90 dagar, sågs en minskad incidens av bronchiolitis obliterans i GCVgruppen första året efter transplantation; 17 respektive 54% p mindre än 0,05 (21). Preemtiv terapi I en öppen randomiserad studie på levertransplanterade visades en sjudagarskur med i.v. GCV vid positivt laboratorietest (blod eller urin) effektivare förhindra CMV-sjukdom än högdos aciklovir i sex månader (22). Incidensen CMV-sjukdom vid sex månader post-transplantation var fyra respektive 29%. I en senare studie där levertransplanterade behandlades vid antigenemi antingen med GCV 10 mg/kg i.v. dagligen i sju dagar eller oralt GCV i sex veckor hittades ingen signifikant skillnad för CMV-sjukdom; 1/11 vs 0/11 (23). Ingen av 50 patienter utan antigenemi fick CMV-sjukdom. Sammanfattning Inga placebokontrollerade studier finns för behandling av CMV-sjukdom hos recipienter av solida organ. Ett fåtal placebokontrollerade dubbel-blinda studier finns för närvarande rörande prevention av CMV-sjukdom hos organtransplanterade. Dessa bygger alla på profylax under längre tid, vanligen tre månader. Framtida behandlingsregimer kommer sannolikt att grunda sig på kombination av profylax till vissa subpopulationer och preemtiv terapi baserad på kvantitativ virusbestämning för övriga. Referenser 1. Sawyer MD, Mayoral JL, Gillingham KJ, Kramer MA, Dunn DL. Treatment of recurrent cytomegalovirus disease in patients receiving solid organ transplants. Arch Surg 1993;128:165-9. 2. Van den Berg AP, van Son WJ, Haagsma EB, Klompmaker IJ, Tegzess AM et al. Prediction of recurrent cytomegalovirus disease after treatment with ganciclovir in solid-organ transplant recipients. Transplantation 1993;55:847-51. 3. Paya CV, Marin E, Keating M, Dickson R, Porayko M et al. Solid organ transplantation: results and implications of acyclovir use in liver transplants. J Med Virol 1993;Suppl:123-7. 4. Ringdén O, Lönnqvist B, Paulin T, Ahlmen J, Klintmalm G et al. Pharmacokinetics, safety and preliminary clinical experiences using foscarnet in the treatment of cytomegalovirus infections in bone marrow and renal transplant recipients. J Antimicrob Chemother 1986;17:373-87. 5. Emery VC, Cope AV, Sabin CA, Burroughs AK, Rolles K et al. J Infect Dis 2000;182:1610-5. 6. Limaye AP, Corey L, Koelle DM, Davis CL, Boeckh M. Emergence of ganciclovir-resistant cytomegalovirus disease among recipients of solid-organ transplants. Lancet 2000;356:645-9. 7. Balfour HH Jr, Chace BA, Stapleton JT, Simmons RL, Fryd DS. A randomized placebocontrolled trial of oral acyclovir for the prevention of cytomeglovirus disease in recipients of renal allograft. N Engl J Med 1989;320:1381-7. 8. Lowance D, Neumayer HH, Legendre CM, Squifflet JP, Kovarik J et al. Valacyclovir for the prevention of cytomegalovirus disease after renal transplantation. International Valacyclovir Cytomegalovirus Prophylaxis Transplantation Study Group. N Engl J Med 1999;340:1462-70. 9. Flechner SM, Avery RK, Fisher R, Mastroianni BA, Papajcik DA et al. A randomized prospective conrolled trial of oral acyclovir versus oral ganciclovir for cytomegalovirus prophylaxis in high-risk kidney transplant recipents. Transplantation 1998;66:1682-8. 10. Hibberd PL, Tolkoff-Rubin NE, Conti D, Stuart F, Thistlethwaite JR et al. Preemptive ganciclovir therapy to prevent cytomegalovirus disease in cytomagalovirus antibody-positive renal transplant recipients. A randomized controlled trial. Ann Intern med 1995;123:18-26. 11. Conti DJ, Freed BM, Singh TP, Gallichio M, Gruber SA et al. Preemptive ganciclovir therapy in cytomegalovirus-seropositive renal transplants recipients. Arch Surg 1995;130:1217-21; discussion 1221-2. 12. Kletzmayr J, Kreuzwiesr E, Watkins-Riedel T, Berlakovich G, Kavarik J et al. Long-term oral ganciclovir prophylaxis for prevention of cytomegalovirus infection and disease in cytomegalovirus high-risk renal transplant patients. Transplantation 2000;70:1174-80. 13. Shen GK, Alfrey EJ, Knoppel CL, Dafoe DC, Scandling JD. Eradication of cytomegalovirus reactivation disease using high-dose acyclovir and targeted intravenous ganciclovir in kidney and kidney/pancreas transplantation. Transplantation 1997;64:931-3. 14. Gane E, Saliba F, Valdecass GJ, O'Grady J, Pescovitz MD et al. Randomised trial of efficacy and safety of oral ganciclovir in the prevention of cytomegalovirus disease in liver-transplant patients. Lancet 1997;350:1729-33. 15. Barkholt L, Lewensohn-Fuchs I, Ericzon B-G, Tydén G, Andersson J. High-dose acyclovir prophylaxis reduces cytomegalovirus disease in liver transplant patients. Transpl Infect Dis 1999;1:89-97. Info från Läkemedelsverket 7/8:2001 35

16. Winston DJ, Wirin D, Shaked A, Busuttil RW. Randomised comparison of ganciclovir and high-dose acyclovir for long-term cytomegalovirus prophylaxis in liver-transplant recipients. Lancet 1995;346:69-74. 17. Badley AD, Seaberg EC, Porayko MK, Wiesner RH, Keating MR et al. Prophylaxis of cytomegalovirus infection in liver transplantation: a randomized trial comparing a combination of ganciclovir and acyclovir to acyclovir. NIDDK Liver Transplantation Database. Transplantation 1997;64:66-73. 18. Martin M, Manez R, Linden P, Estores D, Torre-Cisneros J et al. A prospective randomized trial comparing sequential ganciclovir-high dose acyclovir to high dose acyclovir for prevention of cytomegalovirus disease in adult liver tranplant recipients. Transplantation 1994;58:779-85. 19. Snydman DR, Werner BG, Dougherty NN, Griffith J, Rubin RH et al. Cytomegalovirus immune globulin prohylaxis in liver transplantation. A randomized double-blind, placebo-controlled trial. The Boston Center for Liver Transplantation CMVIG Study Group. Ann Intern med 1993;119:984-91. 20. Rubin RH. Prevention and treatment of cytomegalovirus disease in heart transplant patients. J Heart and Lung Transpl 2000;19:731-5. 21. Duncan SR, Grgurich WF, Iacono AT, Burckart GJ, Yousem SA et al. A comparison of ganciclovir and acyclovir to prevent cytomegalovirus after lung transplantation. Am J Resp Crit Care Med 1994;150:146-52. 22. Singh N, Yu VL, Mieles L, Wagener MM, Miner RC et al. High-dose acyclovir compared with short-course preemptive ganciclovir therapy to prevent cytomegalovirus disease in liver tranplant recipients. A randomized trial. Ann Intern med 1994;120:375-81. 23. Singh N, Paterson DL, Gayowski T, Wagener MM, Marino IR. Cytomegalovirus antigenemia directed pre-emptive prophylaxis with oral versus I.V. ganciclovir for the prevention of cytomegalovirus disease in liver transplant recipients: a randomized, controlled trial. Transplantation 2000;70:717-22. CMV HIV LEO FLAMHOLC Inledning Introduktionen av höggradigt effektiv antiretroviral terapi (HAART) under andra hälften av 1990-talet har dramatiskt påverkat förekomsten av allvarliga CMV-relaterade sjukdomsmanifestationer hos HIVsmittade (1). Tidigare var CMV-retinit en vanligt förekommande komplikation som drabbade en stor del av de AIDS-sjuka. Olika undersökningar har visat att CMV-retinit förekom hos upp till drygt 40% av AIDS-patienter (2,3). Efter införandet av HA- ART har förekomsten av CMV-retinit liksom av andra opportunistiska sjukdomar hos HIV-smittade minskat kraftigt (4,5). CMV-retinit förekommer i stort sett enbart hos patienter med hjälparceller (CD4-celler) under 50/ml blod (2,6). Andra manifestationer av CMV-infektion hos dessa patienter i form av gastrointestinala infektioner i framför allt esofagus och colon (7) och CNS-infektioner som encefalit, polyradikulopati och multifokal neuropati (6). CMV-pneumonit är en ovanlig manifestation av CMV-infektion hos AIDS-sjuka i motsats till förhållandena vid andra typer av immundefekt. CMV-retinit är en klinisk diagnos baserad på typiskt fynd vid funduskopi och som obehandlad på kort tid kan leda till kraftigt nedsatt synförmåga eller blindhet. HAART och CMV Efter introduktionen av HAART har det således skett en dramatisk minskning av incidensen av AIDS-definierande diagnoser inklusive CMV-retinit. EuroSIDA följer prospektivt drygt 7000 HIVsmittade europeiska patienter. I denna grupp registrerades 1994 500 AIDS-definierande diagnoser mot 95 år 1998. Antalet CMV-retiniter minskade under samma tid från 45 till 2 (8). Andra studier bekräftar bilden av en dramatisk minskning av antalet CMV-retiniter (1,9,10). I en studie av konsekutiva patienter som insjuknade med CMV-retinit under tiden januari 1996 till december 1997 jämfördes det kliniska förloppet mellan patienter som erhöll HA- ART i minst tre månader och de som inte fick HA- ART alls eller behandlades mindre än tre månader. HAART-behandling var associerad till förlängd överlevnad, färre recidiv och färre fall av progredierande CMV-retinit (11). I syfte att få en bild av i hur stor utsträckning HAART påverkar immunrekonstitutionen uppmättes graden av CMV-viremi hos en grupp patienter med ett initialt medianvärde på 35 CD4+ med hjälp av en hybrid capture assay. Undersökningen visade att man efter insatt HAART utan samtidig specifik CMV-behandling fick en gradvis minskande CMV-viremi, där antalet CMVkopior/106 leukocyter sjönk från 4,1 log 10 till 2,5 efter ett drygt års behandling (12). I en annan studie 36 Info från Läkemedelsverket 7/8:2001

med liknande uppläggning följdes 16 patienter med CMV-viremi men utan klinisk CMV-sjukdom med upprepade PCR-mätningar under en mediantid av 16 månader. Före insatt HAART var medianvärdet för antalet CMV-kopior 7,6 x 104. Hos samtliga HAART-behandlade patienter nådde man en icke detekterbar CMV-virusnivå utan att någon specifik CMV-behandling gavs (13). Det finns också exempel på fallbeskrivningar där CMV-retinit gått i regress med enbart HAART utan specifik CMV-behandling (14). Profylax Två placebokontrollerade studier av oralt ganciklovir som profylax mot CMV-retinit hos patienter med låga hjälparceller har motstridiga resultat (15,16). Båda studierna genomfördes före HAART-eran. Oralt ganciklovir gavs i en dos av 1 g tre gånger dagligen. I den ena studien, organiserad av Roche, fick man en statistiskt signifikant minskning av CMV-retiniter från 24% i placebogruppen till 12% i ganciklovirgruppen. I den andra studien som genomfördes av National Institute of Health (NIH) fick man inte någon signifikant minskning av antalet CMVretiniter i behandlingsgruppen jämfört med placebogruppen. En möjlig förklaring till skillnaden i resultat mellan studierna var att uppläggningen skilde sig åt beträffande funduskopiundersökningar. I den av Roche organiserade studien utfördes funduskopisk undersökning innan behandlingsstart på samtliga patienter, vilket man inte gjorde i NIH-studien. Oavsett detta har primärprofylax mot CMV-retinit knappast använts i någon större utsträckning utanför kliniska prövningar, och sedan HAART-behandling infördes har det inte heller funnits något behov av att belysa denna fråga ytterligare. Behandling Foscarnet (Foscavir ) och ganciklovir (Cymevene ) och cidofovir (Vistide ) är i Sverige registrerade för systembehandling av CMV-infektioner medan fomirvirsen (Vitravene ) enbart är avsett för lokalt bruk. Foscarnet är en pyrofosfatanalog som hämmar CMV DNA-polymeras. Foscarnet finnes endast i parenteral beredning. Förutom CMV har foscarnet även effekt mot andra herpesvirus inklusive aciklovirresistent herpes simplex (17). För induktionsterapi under två till tre veckor ges foscarnet i en dos av 90 mg/kg i.v. två gånger dagligen och i underhållsbehandling 90-120 mg/kg i.v. en gång dagligen. Doserna reduceras för patienter med nedsatt njurfunktion. Genom extra vätsketillförsel motverkas den nefrotoxicitet som annars är en viktig biverkan av foscarnet (18). Illamående, rubbningar i kalciumbalansen och genitala ulcerationer är andra biverkningar. Ganciklovir är en nukleosidanalog som fosforyleras via virala enzym. Mutationer i UL 97 genen leder till utebliven fosforylering av ganciklovir och därmed resistens (19). Rekommenderad dos är 5 mg/kg i.v. två gånger dagligen för induktionsbehandling under två till tre veckor och 5 mg/kg i.v. dagligen för underhålsbehandling. Ganciklovir finns också i en oral beredningsform som är godkänd för underhållsbehandling men ej för akutbehandling. Rekommenderad underhållsdos är 4 kapslar á 250 mg tre gånger dagligen. Oralt ganciklovir har en låg biotillgänglighet på cirka 5% på grund av begränsad absorption från magtarmkanalen. Valganciklovir är en prodrog till ganciklovir som efter absorption spjälkas till ganciklovir. I en studie av 39 patienter med HIV-infektion och positiv CMV-serologi fann man att man med en daglig peroral engångsdos av 900 mg valganciklovir gav plasmakoncentrationer jämförbara med intravenös tillförsel av 5 mg/kg (20). Således finnes en potential för att valganciklovir kommer att kunna användas för inte bara underhållsbehandling av CMV-infektioner utan även för akutbehandling. Ganciklovir har också använts för intravitreala injektioner och finns också för lokalbehandling som intraokulärt implantat. Den viktigaste biverkningen av ganciklovir är benmärgstoxicitet. Cidofovir finns endast i parenteral beredningsform. I sin aktiva form, cidofovirdifosfat, är halveringstiden intracellulärt beräknad till 65 timmar och cidofovir kan därför doseras en gång per vecka 5 mg/kg i.v. i induktionsbehandling och samma dos varannan vecka som underhållsbehandling. Den viktigaste biverkan av cidofovir är njurtoxicitet med nekros av proximala tubuli. Tillförsel av extra vätska och probenicid minskar njurtoxiciteten. Probenicid verkar genom att kompetitivt hämma upptaget av cidofovir i proximala tubuli. En annan i sammanhanget notabel biverkan är uveit/irit. In vitro har man kunnat påvisa att korsresistens mellan ganciklovir och cidofovir är möjlig även om man kan förutsätta att mutationer i UL 97 genen som påverkar fosforyleringen av ganciklovir och som är den viktigaste resistensmekanismen ej påverkar cidofovirs effekt eftersom cidofovir fosforyleras oberoende av virala enzymer (21). Fomivirsen är en oligonukleotid som hämmar CMV genom en antisensmekanism. Dess nukleotidsekvens är komplementär till mrna från CMV. Användningen av Fomivirsen som således endast är avsett för intravitreal injektion har hittills varit mycket begränsad. Behandling av CMV-retinit innefattar två till tre veckors induktions- eller akutbehandling följd av underhållsbehandling. I en jämförande studie mellan foscarnet och ganciklovir för induktions och underhållsbehandling kunde man inte påvisa någon signifikant skillnad i effektivitet mellan preparaten Info från Läkemedelsverket 7/8:2001 37

avseende CMV-effekt. Däremot hade man längre överlevnad i foscarnetgruppen (22). Detta kan förklaras med det faktum att foscarnet förutom sin CMV-effekt har en direkt anti-hiv effekt. Någon direkt jämförelse mellan cidofovir och övriga preparat för akut- och underhållsbehandling av CMV-retinit finns inte, men bedömningen är att effektiviteten är jämförbar (23). I en studie där 377 patienter med ensidig CMV-retinit randomiserades till antingen ganciklovir i.v. ensamt, ganciklovirimplantat med oralt ganciklovir eller enbart ganciklovirimplantat fann man att incidensen av ny CMV-sjukdom efter sex månader var 20, 24 och 44% i de tre grupperna, det vill säga behandling med enbart implantat hade högre incidens av ny CMV-sjukdom (23). Den sämre effekten kan helt och hållet tillskrivas det faktum att behandling med enbart ganciklovirimplantat ger högre frekvens kontralateral retinit och andra extraokulära sjukdomsmanifestationer än de övriga alternativen. Däremot har man en bättre effekt mot CMV i det behandlade ögat (23). I en jämförande studie mellan ganciklovirimplantat och i.v. ganciklovir fann man att tiden till återfall var signifikant längre för implantatbehandling än för i.v. behandling (24). En fördel med ganciklovirimplantat är att man uppnår en högre lokal läkemedelskoncentration under en längre tid. Nackdelen är att man ej uppnår någon systemeffekt, varför man bör kombinera med oralt ganciklovir. Dessutom förekommer operationskomplikationer såsom endoftalmit, näthinneavlossning, intravitreala blödningar etc. Några jämförande studier av intravitreal behandling med i.v. ganciklovir har ej genomförts. En jämförande studie av behandling av recidiverande retinit har genomförts. Denna kunde visa att kombinationen av ganciklovir i.v. och foscarnet i.v. var effektivare än endera preparatet i monoterapi (25). I en fas I-studie gavs kombinationen cidofovir i.v. 5 mg/kg varannan vecka i kombination med oralt ganciklovir i en dos av 1 g tre gånger dagligen som behandling av CMVretinit (26). Under en medianbehandlingstid av 5,5 månader hade endast en av sju patienter progredierande CMV-retinit, vilket uppfattas som ett i sammanhanget gynnsamt resultat. En fördel med denna behandlingsregim är att den i motsats till ganciklovir eller foscarnet inte kräver en kvarliggande venkateter. Sammanfattningsvis går det inte att utifrån tillgängliga studier hävda att det är någon effektskillnad mellan i.v. ganciklovir, foscarnet och cidofovir för systembehandling. Ganciklovirimplantat har i vissa studier haft en signifikant förlängd tid fram till recidiv jämfört med i.v. underhållsbehandling med något av ovan nämnda preparat. Implantatbehandling bör dock alltid kombineras med systembehandling. Studierna är gjorda innan man hade tillgång till HA- ART, och de avspeglar knappast den verklighet som nu råder. Terapival i det enskilda fallet bör baseras på en individuell bedömning utifrån risk för biverkningar, interaktioner och med hänsyn tagen till patientens individuella förutsättningar för effektiv HA- ART-terapi och därmed möjligheter till immunrekonstitution. Vid behandling av recidiverande CMV-retinit finns data som talar för att en kombination av ganciklovir och foscarnet är att föredra framför något av preparaten var för sig. Valganciklovir tycks ha en fördelaktig farmakokinetik och är ett potentiellt värdefullt tillskott till behandlingsarsenalen. Underhållsbehandling Innan HAART-behandling blev tillgänglig gavs i princip livslång underhållsbehandling mot CMV med i första hand ganciklovir och foscarnet i.v. (3). 17 patienter som behandlats för CMV-retinit och som sattes in på HAART följdes prospektivt efter utsättandet av underhållsbehandling mot CMV. Underhållsbehandlingen sattes ut efter två konsekutiva mätningar av CD4+ på över 70 celler/µl blod. Mediantid från påbörjad HAART till att CMV-behandlingen sattes ut var 8,8 månader. Fem av de 17 patienterna fick recidiv av CMV-retinit med en mediantid av 14,5 månader efter utsatt CMV-behandling. Samtliga patienter som recidiverade sviktade i sin HIV-behandling och hade <50 CD4+ celler. Ingen patient som låg kvar på nivåer över 50 hjälparceller recidiverade (27). Slutsatsen som drogs var att det går bra att sätta ut CMV-underhållsbehandling när CD4-värdet ligger stabilt över 50, och att ånyo sjunkande värden under 50 CD4-celler är förenat med risk för recidiv. Ytterligare ett antal likartade undersökningar har genomförts och givit likartade resultat (28,29,30). Sammantaget förefaller det vara förenat med liten eller ingen risk för recidiv av CMV-retinit om man sätter ut underhållsbehandlingen förutsatt att CD4-nivån ligger stabilt över 50. Immune recovery vitritis I samband med insatt effektiv antiretroviral behandling och därav följande immunrekonstitution hos patienter med genomgången CMV-retinit har man beskrivit ett tillstånd med uppblossande inflammation som har benämnts immune recovery vitritis. Tillståndet karakteriseras av vitrit, papillit och makulaförändringar och kan leda till nedsatt syn. Mekanismerna bakom detta tillstånd är ej helt klarlagda, men den föreslagna förklaringen är att man får en kraftig immunologisk reaktion mot CMV och att det i ögat finns kvarvarande CMV-antigen (31). Liknande fenomen med inflammatorisk reaktion har beskrivits hos patienter som varit infekterade med mycobaktrium avium och påbörjat HAART-be- 38 Info från Läkemedelsverket 7/8:2001